藍(lán)莓多酚的提取及功能性研究進(jìn)展

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（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南 250100；2.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程工學(xué)院，山東濟(jì)南 250353；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濟(jì)南 250100）

藍(lán)莓（Blueberry）屬杜鵑花科越橘屬，多年生落葉或常綠灌木，果實呈深藍(lán)色，披白霜，近圓形，果肉細(xì)膩，果味酸甜，營養(yǎng)豐富。藍(lán)莓的種植歷史相對較短，美國是最早栽培藍(lán)莓的國家，距今也僅有100多年的歷史。20世紀(jì)50年代我國東北出產(chǎn)的野生篤斯越桔開始用于造酒，80年代我國開始引進(jìn)國外品種，目前藍(lán)莓在我國已得到廣泛種植。

1981年，Haslam首次提出植物多酚這一術(shù)語，它將多酚分為單寧及其相關(guān)化合物（如單寧的前體化合物和聚合化合物）和聚黃烷醇類（含縮合單寧和相關(guān)化合物）兩大基本類型。多酚是植物體內(nèi)復(fù)雜的酚類次生代謝產(chǎn)物，具有多元酚結(jié)構(gòu)，主要存在于植物的皮、根、葉、殼及果肉中[1-2]。有關(guān)多酚的分類方法有很多種，類黃酮、花青素、酚酸等都屬于多酚。近幾年，國外學(xué)者根據(jù)多酚結(jié)合方式和萃取方法的不同，將其分為可萃取多酚（extractable polyphenols）和不可萃取多酚（non-extractable polyphenols），所謂可萃取多酚主要是指通過簡單的有機(jī)溶劑萃取或水就可以獲得的處于游離狀態(tài)的多酚，不可萃取多酚主要是指結(jié)合于細(xì)胞壁上的一些水合單寧酸和原花青素，需通過化學(xué)或者酶處理方法，打破多酚物質(zhì)與細(xì)胞壁結(jié)合的化學(xué)鍵，才將其分離出來的部分[3]。目前，我們通常研究的多酚實際上是指可萃取多酚，而沒有考慮不可萃取部分。此外，多酚受組成復(fù)雜、聚合度不同及原料結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異等因素影響，至今尚無一種方法能適用于所有多酚的分離[4]。

1 藍(lán)莓中多酚的萃取

1977年英國學(xué)者Colin F.Timberlake開始研究水果中的多酚，發(fā)現(xiàn)越橘屬植物中含有花青素、芍藥素、花翠素、牽牛色素、錦葵色素等多酚類物質(zhì)[5]。1988年中科院南京植物研究所引種兔眼藍(lán)漿果，并對其中的花青素、花色苷等多酚成分進(jìn)行檢測[6]。1996年加拿大研究中心采用聚乙烯萃取法，研究發(fā)現(xiàn)低叢藍(lán)莓中花青素類的含量為6.08 mg/g-10.22 mg/g[7]。劉文旭、黃午陽等使用80%乙醇對藍(lán)莓進(jìn)行多酚萃取，28℃震蕩24 h后，以沒食子酸為標(biāo)物，獲得藍(lán)莓全果中總酚含量為（9.44±0.22）mg/100 g DW[8]。Matsuo等使用甲醇作為初步溶劑萃取藍(lán)莓葉凍干粉中的多酚，提取3次后過濾，然后使用70%丙酮進(jìn)行進(jìn)一步的萃取過濾，最終測得凍干的藍(lán)莓葉中多酚的含量為11.3%[9]。

隨著科技的進(jìn)步，人們開始使用更先進(jìn)的方法如酶法提取、超聲輔助萃取法、微波輔助萃取法、減壓萃取法等萃取藍(lán)莓多酚，這使多酚的萃取率得到明顯提高。李穎暢等使用酶法提取藍(lán)莓果中的花色苷，結(jié)果表明：在纖維素酶用量為5 mg/g，料液比為1∶8（g/mL），pH為5.0，提取時間60 min，酶解溫度45℃的條件下，提取2次，花色苷萃取率可達(dá)350 mg/100 g FW[10]。趙爾豐等以藍(lán)莓果渣為原料，采用酶-超聲波輔助提取法提取果渣中的花青素，在纖維素酶用量為5 mg/g，溫度50℃，料液比1∶10的條件下，采用超聲震蕩條件，提取功率為200 W，時間20 min，然后補(bǔ)充加入40%乙醇，超聲波強(qiáng)化提取10 min，所得藍(lán)莓果渣中花青素的提取率為4.12%[11]。解利利等使用微波輔助萃取法，將藍(lán)莓凍果進(jìn)行整果破碎后，加入無水乙醇用微波提取法提取多酚，干燥后測得單寧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.29%，總單體花色苷為1.54%，黃酮為0.22%[12]。馮進(jìn)等采用減壓萃取法對藍(lán)莓葉中的多酚進(jìn)行萃取條件優(yōu)化，最終得出最佳提取條件為：在真空度-0.07 MPa，乙醇濃度 60%，pH3.5，料液比 1∶50，物料粒度 80目～100目的條件下，提取60 min，多酚提取率為81.47%，多酚純度為45.32%，其中多酚純度比常壓提取高6.57%[13]。由于原料及萃取工藝的不同，藍(lán)莓多酚的萃取率差別較大，因此選擇合適的萃取工藝顯得尤為重要。

上述方法萃取的多酚（花青素）均指的是可萃取部分，早在20世紀(jì)70年代，不可萃取原花青素就在豆科植物中被發(fā)現(xiàn)，但由于當(dāng)時缺乏先進(jìn)的分析及檢測手段而未受到重視，直至上世紀(jì)90年代國外科學(xué)家才開始對蔬果中的不可萃取多酚進(jìn)行深入研究。1996年愛爾蘭科學(xué)家Sara Matthews等提出植物中存在可萃取花青素和不可萃取花青素，他用樹皮作為研究對象從甲醇萃取后的渣中使用硫解法和凝膠色譜法萃取并測定不可萃取花青素，得到的結(jié)論是有近97%的樹皮中含有不可萃取花青素[14]。西班牙學(xué)者Sara Arranz指出不可萃取多酚主要是指存在于膳食纖維和蛋白質(zhì)中的可水解單寧和原花青素[3]。2007年Fulgencio Saura-Calixto等人先使用甲醇和丙酮萃取蔬果中的可萃取多酚，然后使用5 ml/L的HCl-丁醇溶液，100℃水浴3 h，萃取結(jié)合原花青素（Condensed tannins），又用甲醇/硫酸（90∶10）溶液萃取可水解單寧（Hydrolysablepolyphenols），最終獲得不可萃取多酚溶液[15]。直到2011年國內(nèi)才開始有人關(guān)注并研究不可萃取多酚，程安瑋等使用甲醇/H2SO4萃取液，80℃加熱20h，冷卻后4000r/min，離心5 min，測得藍(lán)莓葉中不可萃取多酚的含量為（44.93±0.38）mg/g[4]。研究證明果蔬原料中的不可萃取多酚的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于可萃取多酚的含量，這些成分可被人體結(jié)腸中細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對人體十分有益。

2 多酚的分離純化

通過簡單的溶劑萃取、超聲輔助萃取法等只能獲得多酚粗液，要想得到純度較高的多酚，就需要對獲得的粗提液進(jìn)一步分離純化。目前最常用的純化方法有吸附分離法、柱層析分離法和色譜分離法等。

2006年鄒陽等以藍(lán)莓色素粗提液為原料，使用AB-8大孔吸附樹脂對藍(lán)莓花色苷精制工藝進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在樹脂吸附流速為10 mL/min，解吸流速為5 mL/min時，用pH為2的80%的乙醇溶液解吸效果最佳，飽和吸附量為39.098 mg/mL，精制色素色價可達(dá)175，是國標(biāo)的40多倍[16]。李知敏采用聚酰胺樹脂對藍(lán)莓中的花色苷進(jìn)行純化，使用50%的乙醇進(jìn)行洗脫，結(jié)果得到花色苷的純度為46.35%，色價為2047，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國際上規(guī)定的花色苷類物質(zhì)醫(yī)藥用品原料含量大于20%的標(biāo)準(zhǔn)[17]。2011年呂業(yè)春等先用70%的乙醇，50℃超聲輔助萃取30 min，然后使用XAD-7大孔樹脂純化藍(lán)莓多酚萃取液，除去糖分和蛋白等物質(zhì)，測得大興安嶺野生藍(lán)莓的總酚含量為（573.9±6.9）mg/100 g，總花色苷含量為（156.1±9.1）mg/100 g，占總酚的 27.2%[18]。

3 藍(lán)莓中多酚的組成

由于多酚成分復(fù)雜，主要受采摘季節(jié)、品種、栽培條件等多因素的影響，因此藍(lán)莓中多酚的組成和含量不穩(wěn)定。目前，已有明確的研究證明藍(lán)莓中含有兒茶素、茄紅素、碧蘿芷、白藜蘆醇（反轉(zhuǎn)醇）等，還有一些酚酸類黃酮等的研究則不是很明確。Matsuo等經(jīng)研究指出藍(lán)莓葉中多酚的主要成分為低聚花青素，另外還含有綠原酸、槲皮素糖苷、黃酮苷、黃烷-三醇、兒茶素等[19]。通過查閱大量文獻(xiàn)可總結(jié)得出藍(lán)莓果中主要含有的多酚為花青素、原花青素、花色苷、綠原酸、沒食子酸、黃酮醇苷等，野生種中還含有黃色槲皮苦素、楊梅酮等物質(zhì)。

4 藍(lán)莓多酚的功能性研究

藍(lán)莓最早產(chǎn)于美國，早在上個世紀(jì)初，國外便開始進(jìn)行選種人工培養(yǎng)，到20世紀(jì)六七十年代，國外科學(xué)家開始研究藍(lán)莓中的營養(yǎng)成分。1976年法國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓中含有氨基酸、花青素、黃烷醇等物質(zhì)。從20世紀(jì)末科研工作者開始關(guān)注并研究藍(lán)莓中的天然活性成分（多酚），研究表明藍(lán)莓多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等多種活性。研究表明，多酚分子結(jié)構(gòu)中具有活潑的羥基氫，能終止自由基的連鎖反應(yīng)，捕獲過量的自由基，因此是一類理想的天然抗氧化劑[20]。

4.1 抗氧化活性

20世紀(jì)80年代以來，國內(nèi)外對多酚生物活性作用作了大量研究，揭示了其抗氧化作用機(jī)理?？寡趸瘎┑淖饔脵C(jī)理可分為兩大類型，即阻滯型和鏈斷型。前者降低鏈反應(yīng)速率，而后者則通過俘獲鏈反應(yīng)的自由基R’和ROO’來干擾鏈的增殖[20]。

2001年美國農(nóng)業(yè)部對40種果蔬進(jìn)行抗氧化對比試驗，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓是抗氧化能力最好的水果之一。法國笛卡爾大學(xué)藥學(xué)院研究表明藍(lán)莓是一種強(qiáng)力抗氧化劑，可以防止或限制由氧化應(yīng)激所引起的眼部病變。2002年加拿大學(xué)者Colin D.Kay和Bruce J.Holub對矮叢野生藍(lán)莓進(jìn)行餐后血清抗氧化人體試驗。選擇了8位健康的成年男性，讓他們每天餐后服用100 g野生藍(lán)莓凍干粉，結(jié)果表明人體血液中的血清抗氧化能力明顯增強(qiáng)，血脂也有所下降[21]。2004年美國學(xué)者Steven R.McAnulty等讓9名受試者在高溫條件下跑步，一組攝入藍(lán)莓多酚，另一組攝入VC，結(jié)果表明藍(lán)莓多酚更適合高溫條件下訓(xùn)練的運(yùn)動員服用[22]，這主要是由多酚的抗氧化性所介導(dǎo)的。2008年希臘學(xué)者M(jìn)agdalini A.Papandreou等利用小鼠的大腦細(xì)胞對野生藍(lán)莓多酚的抗氧化性及抑制乙酰膽堿酶的活性進(jìn)行研究，通過腹腔注射藍(lán)莓多酚溶液，7 d后測定小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力得到明顯改善，抗氧化能力增強(qiáng)，抗壞血酸濃度升高，還原性谷光氨肽含量增多[23]。

我國對藍(lán)莓的研究開始較晚，早期主要集中在藍(lán)莓種植栽培方面，近幾年開始關(guān)注藍(lán)莓的功能性研究。2004年，盧艷華等對藍(lán)莓的兩個品種歐洲越桔和篤斯越桔的標(biāo)準(zhǔn)植物提取物（原花色苷25%）進(jìn)行清除自由基和體外抗氧化活性比較，發(fā)現(xiàn)篤斯越桔清除O2-自由基、DPPH自由基的能力及抗小鼠微粒體膜脂氧化的能力優(yōu)于歐洲越桔[24]。解利利等研究表明藍(lán)莓凍果的多酚粗提物具有很強(qiáng)的清除過氧化氫、羥基自由基和亞硝酸鹽的能力，且還原能力及清除超氧陰離子能力可達(dá)到VC水平[11]。

4.2 抗腫瘤活性

研究表明，藍(lán)莓多酚具有明顯的抗癌活性，能夠抑制使癌細(xì)胞增殖的酶的活性。2005年美國喬治亞大學(xué)的Weiguang Yi等以肝癌細(xì)胞（HepG2）為模型對藍(lán)莓多酚的抗癌作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明在含量為12 mg/mL的藍(lán)莓多酚溶液中培養(yǎng)人體肝癌細(xì)胞，50%的癌細(xì)胞生長受到抑制[25]。

4.3 其他活性

藍(lán)莓多酚除了具有上述功能外，近年來研究還發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓多酚的許多其他功能，例如：藍(lán)莓多酚具有分解脂肪細(xì)胞及抑制脂肪細(xì)胞生成的作用，2011年英國《每日郵報》報道：美國德克薩斯女子大學(xué)研究人員利用實驗鼠脂肪組織進(jìn)行實驗發(fā)現(xiàn)，取自藍(lán)莓的多酚類物質(zhì)對脂肪具有分解作用。多項測試研究結(jié)果顯示，大量攝入多酚類物質(zhì)可以使脂肪細(xì)胞減少73%，小劑量攝入也可以使脂肪細(xì)胞削減27%。

另外，藍(lán)莓在歐洲被稱為口服的皮膚化妝品，可防止皮膚皺紋的提早生成，更能補(bǔ)充營養(yǎng)及美白皮膚，提高皮膚彈性，其原因就是藍(lán)莓多酚中的花青素對皮膚具有雙重作用：其一它可以促進(jìn)膠原蛋白形成適度交聯(lián)；其二它作為一種有效的自由基清除劑，可預(yù)防皮膚發(fā)生“過度交聯(lián)”，從而阻止皮膚上皺紋和囊泡的出現(xiàn)，花青素還可以阻止硬性蛋白酶的產(chǎn)生并抑制其活性，阻止自由基或彈性蛋白酶降解硬性蛋白，從內(nèi)部明顯改善皮膚的健康狀況。

目前我國也有不少學(xué)者正在從事藍(lán)莓功能性研究，呂業(yè)春等通過建立體外肝細(xì)胞脂肪累積模型，評價藍(lán)莓多酚具有清除肝細(xì)胞脂肪累積的能力，揭示了藍(lán)莓對脂肪肝的潛在預(yù)防作用。他們用油酸（OA）誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪累積并建立模型，分別從噻唑蘭染色吸光度（MTT）值、甘油三酯（TG）值、細(xì)胞內(nèi)脂滴形態(tài)三個方面評價藍(lán)莓多酚的作用，結(jié)果表明，藍(lán)莓多酚能顯著降低1.0 mmol/LOA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪累積，其中100 μg/mL藍(lán)莓多酚對TG的清除率達(dá)到40%[18]。

5 結(jié)語

多酚類化合物是一類活性較強(qiáng)的抗氧化物質(zhì)，從生物材料中尋找天然多酚是目前研究的熱點。大量的實驗研究證明，藍(lán)莓中的多酚含量非常高，具有多種生物活性。如果考慮不可萃取多酚，水果中有益多酚如原青花素、鞣花酸、兒茶酚的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們的估計。這些多酚是人類食物的重要組成，具有重要的保健特性，在營養(yǎng)及流行病學(xué)研究中考慮到它的作用可以使人們更好的理解植物性飲食對人類健康的作用。

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