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    分子生物學(xué)技術(shù)在臨床獸醫(yī)學(xué)上的研究與應(yīng)用

    2014-04-06 09:07:57肖延光郝占忠魏雅茹王素紅趙愛民山東省聊城市畜牧站252000
    山東畜牧獸醫(yī) 2014年3期
    關(guān)鍵詞:核苷酸探針多態(tài)性

    肖延光 郝占忠 魏雅茹 王素紅 趙愛民 (山東省聊城市畜牧站 252000)

    近年來,生物技術(shù)不斷向深度和廣度迅猛發(fā)展,其發(fā)展與動物疫病的診斷、預(yù)防和治療技術(shù)之間已并無明顯的界限,并且起了不可替代的作用;如轉(zhuǎn)基因動物既能用于抗病育種,也能用于生產(chǎn)疫苗和藥品;核酸疫苗具有預(yù)防和治療的雙重作用;單克隆抗體不但用于免疫診斷,也可用于被動免疫和導(dǎo)向藥物治療等。生物技術(shù)已經(jīng)不是一項單一的技術(shù),而是一個綜合的技術(shù)體系,尤其是在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用、發(fā)展中,需要多種不同技術(shù)、學(xué)科和領(lǐng)域的相互滲透、相互配合。

    1 核酸的分子雜交

    基因探針技術(shù)是臨床應(yīng)用最早的分子生物學(xué)技術(shù),至今仍常盛不衰,它不僅用于微生物等基因鑒定方面,而且在印跡技術(shù)如(southern blot)方面以及新近成為熱門的基因芯片技術(shù)方面都有廣泛應(yīng)用,不少探針已商品化。

    2 PCR技術(shù)

    PCR技術(shù)是一種體外模仿體內(nèi)DNA復(fù)制(擴(kuò)增)過程的技術(shù)??梢栽诙虝r間內(nèi)大量復(fù)制出原來很少的DNA。其作為一種新的疾病檢測手段,具有靈敏、特異、簡便、快速等優(yōu)點,可以從一根毛發(fā)、一滴血、一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析診斷;PCR技術(shù)已逐漸應(yīng)用于遺傳性疾病、腫瘤及感染性疾病等的診斷。但該技術(shù)大多為定性分析,結(jié)果重復(fù)性差、可靠性低。因而,給臨床診斷帶來混亂。近年來常規(guī)PCR技術(shù)用于診斷、鑒定、科研、制備探針和進(jìn)一步結(jié)合基因工程進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)等,是一項極其有效、非常實用的技術(shù),隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展已衍生出許多新方法新技術(shù),如:定量PCR技術(shù)、熒光PCR技術(shù)、巢式PCR、不對等PCR等。(1)定量PCR技術(shù):定量PCR技術(shù)巧妙利用了PCR技術(shù)的DNA高級擴(kuò)增、探針技術(shù)特異性和光譜技術(shù)的敏感性及定量分析的優(yōu)點??朔顺R?guī)PCR定性檢測的一些不足,極大地提高了檢測的敏感性和特異性。(2)熒光PCR技術(shù):對比常規(guī)PCR技術(shù),其是一種良好的檢測HBV-DNA的方法。試驗特異性強、重復(fù)性好(批內(nèi)、批間變異系數(shù)均<5%),檢出陽性率和敏感性高。試驗條件標(biāo)準(zhǔn)化后,將有良好的臨床應(yīng)用價值。

    3 DNA(基因)酶切圖譜分析

    (1)DNA(基因)酶切圖譜分析即用特定的限制性酶消化(水解切斷)DNA長鏈后,可以得到核酸的片段。由于不同的DNA堿基序列不同,用識別某一特定堿基序列的限制酶進(jìn)行酶切時,所得到的DNA鏈片段的長短也不一樣(Makimura等,2002)。片段的長短可用凝膠電泳進(jìn)行分離后,與一系列已知分子量(或堿基對,bp)的標(biāo)準(zhǔn)參照物(或稱標(biāo)志物,marker)進(jìn)行比較,大體計算出各片段的分子量或堿基數(shù)。這一方法已廣泛應(yīng)用于臨床基因診斷。例如,當(dāng)一個基因發(fā)生點突變后引起某一限制酶識別點改變,就可以用本法檢測出來。(2)臨床和科研中已沿用多年的DNA限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP ),就是本法具體應(yīng)用的典型例子(Yu等,2002)。在畜群中,各個體基因的核苷酸序列會存在一定差異,稱為基因多態(tài)性?;蚨鄳B(tài)性位點普遍存在于動物的基因組中,某一致病基因與特定的多態(tài)性片段緊密連鎖,就可以用這一多態(tài)性片段作為一種“遺傳標(biāo)記”來判斷畜群或幼畜是否攜帶有致病基因。目前認(rèn)為基因多態(tài)性是個體的“身份證”;有的雖然不表現(xiàn)疾病,但也許會影響對藥物的反應(yīng)和用藥效果,因而有人提出將來會出現(xiàn)按個體基因型選擇用藥的種類和劑量的所謂“個體化”用藥。

    4 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析

    單鏈構(gòu)象多態(tài)性是一種簡單、有效、快捷、廉價的檢測非常少量的基因組DNA或cDNA突變的技術(shù)。其原理及技術(shù)要點是:由于單一堿基的替代(改變),引起DNA鏈構(gòu)象改變(Calegari等,2002)。后者可導(dǎo)致DNA在非變性凝膠電泳中出現(xiàn)遷移率的改變。因此,首先用PCR技術(shù)擴(kuò)增所檢驗的模板,然后進(jìn)行變性、電泳、顯示,根據(jù)顯示的條帶與標(biāo)準(zhǔn)參照物對比,即可判斷所測DNA鏈?zhǔn)欠裼凶儺悺?/p>

    5 DNA序列測定

    上述方法僅能大致了解某一核苷酸鏈片段是否存在變異,并不能確定哪一位點核苷酸發(fā)生變異和何種核苷酸取代了何種核苷酸,這就要求進(jìn)行基因測序。關(guān)于DNA測序的方法,因其十分復(fù)雜,一般臨床實驗室無法進(jìn)行。有必要時可委托有條件的公司或研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行,本文從略。由近幾年世界范圍進(jìn)行的人類基因組計劃(其主要步驟是基因測序)可知,當(dāng)今基因測序是一項大規(guī)模工程,可以自動化進(jìn)行。

    6 DNA微陣列(DNA microarray)技術(shù)

    DNA微陣列技術(shù)又稱蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)、生物芯片(biochip)技術(shù),其是當(dāng)前分子生物學(xué)領(lǐng)域最熱門的技術(shù),國內(nèi)外在競相開發(fā),微陣列技術(shù)的大致步驟是:在一小片固相基質(zhì)(如修飾過的玻璃或尼龍膜片)上,高密度地點上成千上萬個DNA片段,制成微陣列,即DNA或生物芯片。檢測時采用分子雜交手段,將熒光標(biāo)記的標(biāo)本與微陣列進(jìn)行雜交,雜交完成并洗滌后,用激光共聚焦顯微掃描儀檢測熒光信號,通過微機(jī)處理分析,即可獲得檢測結(jié)果(Ja-cobs等,2003)。目前國內(nèi)外已制出多種生物芯片商品,其實際應(yīng)用亦已逐步展開。據(jù)文獻(xiàn)報道,微陣列技術(shù)應(yīng)用范圍極廣如致病微生物的檢出、癌基因及抑癌基因、組織配型、基因表達(dá)的研究、基因功能分析、基因制圖、基因突變和多態(tài)性的檢測等,是一項非常有發(fā)展前景,適合臨床檢驗應(yīng)用的先進(jìn)技術(shù)。

    7 熒光原位雜交染色體分析(FISH)

    熒光原位雜交染色體分析是一種在染色體上進(jìn)行基因定位的技術(shù),其基本原理和步驟是:在已知某靶基因核苷酸序列的前提下,先合成與靶基因互補的經(jīng)熒光標(biāo)記的DNA探針,與常規(guī)方法制備的中期染色體進(jìn)行原位雜交。在熒光顯微鏡下可以觀察到該靶基因所在的染色體(臂、區(qū)、帶、亞帶)(Home等,2002)。其是一項非常有用的技術(shù),它不僅可用于基因在染色體上定位的研究,而且可直接用于實驗室診斷。例如,慢性髓系白血病患者的9號與22號染色體的長臂相互易位所形成的Ph染色體,形成了一個融合基因—bcrabl(并編碼表達(dá)一種叫P120BCR/ABL的蛋白質(zhì)),這是該病發(fā)病的重要因素。早先用染色體分析鑒定這種染色體變異,準(zhǔn)確性差,陽性率也不高(Blasberg,2002)。改用bcrabl基因探針進(jìn)行原位雜交很容易鑒定,并且不一定需要分裂中期的染色體,在核內(nèi)處于間期的染色體也可檢出。目前在各類白血病中,已鑒定出好幾種類似的融合基因(Chatziioannou,2002)。為此,當(dāng)前對白血病的實驗室診斷,已由過去的M(形態(tài)學(xué))I(免疫學(xué),即細(xì)胞表面分化抗原CD )C(細(xì)胞化學(xué)染色)改為MICM,后一M即指分子生物學(xué)。FISH在基因定位研究和診斷中的應(yīng)用還很多。

    8 單抗阻斷ELISA檢測副雞嗜血桿菌血清型特異性抗體

    苗得園等在副雞嗜血桿菌A,C型特異性單克隆抗體的基礎(chǔ)上成功建立了能區(qū)分A,C血清型抗體的阻斷ELISA診斷方法(Maclean等,2003)。并應(yīng)用此法對9種常見病原體陽性血清及多份免疫雞、人工感染雞、臨床可疑病雞血清和陰性血清進(jìn)行了檢測,結(jié)果證明,本法具有較好的特異性和敏感性,而且操作簡便、快速,是一種適用于雞傳染性鼻炎的診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢疫和監(jiān)測的良好方法。

    一般來說,常規(guī)診斷技術(shù)具有應(yīng)用簡便、快速、易于掌握、費用低等優(yōu)點,是經(jīng)歷了漫長的歷史發(fā)展過程得以鞏固和完善的,因此,具有比較強的生命力。而生物高科技診斷技術(shù)卻不具備這樣的優(yōu)勢,不論是單克隆抗體還是核酸探針PCR等,其試劑的制備方法都比較復(fù)雜,需要昂貴的儀器設(shè)備和診斷試劑,對操作者的技術(shù)要求也較高,甚至對檢測結(jié)果的綜合評價也不很容易掌握(Her-schman,2003)。但是,現(xiàn)代生物技術(shù)作為一種高新技術(shù),有著常規(guī)診斷方法不能比擬的優(yōu)越性,分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有極高的敏感性與特異性,能夠區(qū)別細(xì)菌和病毒的疫苗株和野毒株,甚至可區(qū)別病毒間單個核苷酸的差別,可以監(jiān)測病原體的變異和漂移,預(yù)報疫病的大流行(杜立新,2003),核酸探針和PCR技術(shù)還可檢測出整合到宿主體內(nèi)的病原體,對于進(jìn)行毒株鑒定、檢測隱性感染和免疫損害性疾病都具有重要意義。

    因此,雖然在短時間內(nèi)這些診斷新技術(shù)難以真正達(dá)到推廣應(yīng)用,但對于重大疫情的及時預(yù)報和準(zhǔn)確定性都是不可或缺的。

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