甲病毒載體構(gòu)建與應(yīng)用研究進(jìn)展

郭全海 趙耀光 （商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程系 河南 商丘 476000）

甲病毒載體是近年研究比較熱的一種新型載體，對(duì)載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)機(jī)體的免疫作用機(jī)制、構(gòu)建高效疫苗等方面研究較多，也取得了很大的成果。甲病毒載體的利用具有良好的前景，但其安全性和存在的問題還有待進(jìn)一步研究。

甲病毒(Alphavirus)屬于披膜病毒科(Togaviridae)，包括辛德畢斯病毒(Sindbis virus, SIN)、西門利克森林病毒(Semliki Frost virus, SFV)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus, VEE)等30個(gè)成員[1]。甲病毒可感染眾多無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，引起人畜出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹和關(guān)節(jié)痛等疾病。人們?cè)谘芯窟@類由吸血昆蟲傳播的病毒時(shí)，發(fā)現(xiàn)該屬病毒結(jié)構(gòu)和生活史簡(jiǎn)單，能在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)大量復(fù)制，合成與復(fù)制無關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白可達(dá)細(xì)胞總蛋白的25%，并在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此利用甲病毒的這類生物學(xué)特性進(jìn)行改造，構(gòu)建出相應(yīng)的甲病毒載體，已被應(yīng)用于基因治療和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。

1 甲病毒載體的構(gòu)建

1.1 構(gòu)建機(jī)制 由于病毒結(jié)構(gòu)蛋白和復(fù)制酶是由不同的RNA翻譯，由亞基因組RNA翻譯的結(jié)構(gòu)蛋白并不參與病毒的復(fù)制過程，因此缺失了結(jié)構(gòu)蛋白的甲病毒基因組RNA與完整病毒基因組RNA一樣，具有感染性、宿主范圍廣泛、能自我復(fù)制以及誘導(dǎo)被感染細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡等特征。研究人員根據(jù)甲病毒的這類生物學(xué)特性對(duì)甲病毒進(jìn)行了改造，構(gòu)建出相應(yīng)甲病毒載體。最初，Davis等[2]在野毒VEEV的基因組cDNA的結(jié)構(gòu)蛋白基因中直接插入外源基因，進(jìn)行了融合表達(dá)。采用這種方式產(chǎn)生的病毒重組子并不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生野生型的病毒粒子，安全性不高。人們提出了由輔助質(zhì)粒提供復(fù)制非必需的結(jié)構(gòu)蛋白基因或者直接缺失病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的策略代替直接在甲病毒基因組中直接外源蛋白基因，提高了甲病毒載體的安全性和穩(wěn)定性。

1.2 RNA復(fù)制子載體 Liljestrom等[3]構(gòu)建了將病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因分開的SFV表達(dá)載體系統(tǒng)，在這一載體系統(tǒng)，非結(jié)構(gòu)蛋白上游為噬菌體SP6或T7聚合酶啟動(dòng)子，病毒的結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)被刪除但仍含有包裝信號(hào)(VPs)，以及亞基因組啟動(dòng)子(PSG)。病毒輔助質(zhì)粒載體含有完整的結(jié)構(gòu)蛋白基因和主要的順式調(diào)控作用元件。這種結(jié)構(gòu)必須在通過SP6或T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子在體外對(duì)“全基因組”進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和加帽，獲得5’端含有帽子結(jié)構(gòu)的重組RNA，用于體外表達(dá)或免疫動(dòng)物。這種系統(tǒng)以原核啟動(dòng)子(SP6)啟動(dòng)，表達(dá)效率不高，操作也不便。

1.3 DNA-RNA 載體 Diciommo等[4]將RNA復(fù)制子系統(tǒng)改建成了以DNA為基礎(chǔ)的甲病毒載體，又稱DNA-RNA系 統(tǒng)。這種載體為攜帶了病毒復(fù)制酶基因和外源基因的重組質(zhì)粒DNA，缺失了病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因。它通過RNA聚合酶Ⅱ依賴性的表達(dá)序列啟動(dòng)自我復(fù)制的甲病毒載體的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)在甲病毒本身的終止信號(hào)(A69)后插入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)SV40poly(A)，使得轉(zhuǎn)錄正常終止和RNA的3’末端加上進(jìn)一步增強(qiáng)其穩(wěn)定性polyA(A)尾。DNA質(zhì)粒載體彌補(bǔ)了甲病毒RNA復(fù)制子疫苗必須進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和操作、保存和運(yùn)輸均不便的缺點(diǎn)。

1.4 甲病毒載體誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)的作用機(jī)制 甲病毒載體在宿主細(xì)胞中利用細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)RNA復(fù)制酶，使甲病毒復(fù)制子高效復(fù)制，并在宿主胞質(zhì)內(nèi)大量表達(dá)外源基因。Hang等[5]發(fā)現(xiàn)由SIN復(fù)制子表達(dá)的CAT與相應(yīng)分子結(jié)合后被含有TCR／CD3復(fù)合物的CD8+T細(xì)胞識(shí)別，CD8+T細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮CTL的殺傷作用。被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞釋放分泌型的抗原，刺激B細(xì)胞生成抗體。同時(shí)抗原被抗原遞呈細(xì)胞(APC)攝取，經(jīng)過一系列的生化反應(yīng)，促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化，發(fā)揮體液免疫作用[6]。用甲病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可激活與甲病毒感染相似的細(xì)胞抗病毒防御途徑，導(dǎo)致感染細(xì)胞的凋亡。Der等發(fā)現(xiàn)凋亡的宿主細(xì)胞被表面具有αVβ5受體的樹突狀細(xì)胞俘獲處理后提呈給CD8+T細(xì)胞，可激發(fā)強(qiáng)而有力的細(xì)胞免疫[7]。

2 甲病毒載體的開發(fā)與應(yīng)用

2.1 構(gòu)建高效的疫苗載體 由于甲病毒載體的優(yōu)良作用，現(xiàn)被廣泛的用于預(yù)防性和治療性疫苗的研究中。Leitner等[8]用Sindbis、SFV載體與腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的模式抗原lacZ構(gòu)建的復(fù)制子免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)兩者均產(chǎn)生了較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，并能抵抗同源腫瘤細(xì)胞的攻擊，還能顯著延長(zhǎng)已建立腫瘤小鼠的存活時(shí)間。鄧瑤等[9]使用等量的pSFV-SS1和pCDNA3.1-SS1分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，前者表達(dá)強(qiáng)度是后者的3倍，誘導(dǎo)凋亡的能力是后者的11倍；較低劑量的SFV DNA疫苗可誘生與常規(guī)DNA疫苗高劑量組相近的結(jié)果。Wolfgang等[10]用攜帶了自身腫瘤抗原酪氨酸激酶相關(guān)蛋白-1的SIN復(fù)制子免疫小鼠發(fā)現(xiàn)，其可以打破小鼠機(jī)體自身的免疫耐受，并使小鼠對(duì)黑色素瘤產(chǎn)生免疫。Onate等[11]用攜帶流產(chǎn)布氏桿菌B.abortus的Cu，Zn 超氧化物歧化酶(SOD)基因的重組的SFV載體腹腔接種的小鼠，能夠有力的抵抗B.abortus的攻擊。雖然較多的研究表明甲病毒載體疫苗具有較好的免疫效果，但也有反面的報(bào)道。張健慧等[12]比較了攜帶HIV-1 Pr55gag的SFV復(fù)制子和傳統(tǒng)DNA疫苗在小鼠中的體液免疫原性，發(fā)現(xiàn)用0.1和1.0μg的SFV及pcDNA-gag表達(dá)質(zhì)粒肌肉注射小鼠均不能誘導(dǎo)出GAG特異性免疫反應(yīng)。而分別用載體pSFV及pcDNA-gag表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠，后者誘導(dǎo)的ThⅠ型GAG特異性抗體高于前者，產(chǎn)生這種結(jié)果與載體攜帶的抗原有關(guān)。

2.2 構(gòu)建低致細(xì)胞病變型載體 Schlesinger等[13]發(fā)現(xiàn)普通的甲病毒載體可在導(dǎo)致宿主細(xì)胞在72h內(nèi)出現(xiàn)凋亡。宿主細(xì)胞過早凋亡，使得外源基因不能持續(xù)表達(dá)，不利于外源蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫細(xì)胞對(duì)其的加工呈遞。Weiss等[14]用SINV突變株SIN-1在BHK-21細(xì)胞上建立了持續(xù)感染，且對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不大。進(jìn)一步對(duì)這類低致細(xì)胞病變株分析表明，非結(jié)構(gòu)蛋白nsP2可能是決定甲病毒致細(xì)胞病變能力的關(guān)鍵因素之一[15]。SIN復(fù)制子的非結(jié)構(gòu)蛋白nsP2的721位氨基酸由Pro突變?yōu)镾er后，能夠在BHK-21細(xì)胞上建立持續(xù)性的感染。攜帶了β-半乳糖苷酶基因的該SIN突變復(fù)制子較普通SIN載體具有更高的蛋白表達(dá)能力。將nsP2的721氨基酸由Pro突變?yōu)镾er，則會(huì)降低SINV基因組RNA的復(fù)制能力從而降低致細(xì)胞病變的能力；將Pro突變?yōu)長(zhǎng)eu，進(jìn)一步降低RNA的合成和SIN復(fù)制子的細(xì)胞毒性[16]。Lundstrom等[17]將nsP2胞核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域的第649位氨基酸由Arg突變?yōu)锳sp，第259位由Ser突變?yōu)镻ro，這樣的SFV復(fù)制子SFV(PD)降低了細(xì)胞毒性，并能夠在初級(jí)海馬趾和皮層神經(jīng)元中增強(qiáng)外源基因的表達(dá)。Petrakova等在委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)載體的RNA的5’非翻譯區(qū)和nsP2、nsP3中引入點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)突變載體能夠在BHK-21中建立持續(xù)感染，并且其致細(xì)胞病變能力低于普通SIN載體[18]。利用低致細(xì)胞病變株甲病毒改造成的甲病毒載體，擴(kuò)大了自身在免疫治療、細(xì)胞發(fā)育特殊的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等研究上的應(yīng)用。

2.3 構(gòu)建溫度敏感型載體 Boorsma等[19]在無細(xì)胞致病性SFV株的nsP4上引入153號(hào)氨基酸(G→F)的突變后，發(fā)現(xiàn)攜帶了毒性蛋白分子基因的SFV載體在29℃時(shí)，即可在宿主細(xì)胞中獲得最大表達(dá)，而在37℃檢測(cè)不到表達(dá)活性。Lundstrom等[20]在SFV突變株(PD)的nsP2的713號(hào)氨基酸再次引入點(diǎn)突變，可使該低宿主細(xì)胞致病型載體在31℃條件下在宿主細(xì)胞中存活，并延長(zhǎng)外源基因表達(dá)達(dá)20d以上。這說明甲病毒載體中nsP2、nsP4蛋白裂解結(jié)構(gòu)域的部分氨基酸殘基發(fā)生點(diǎn)突變，可增強(qiáng)甲病毒載體對(duì)溫度的敏感性。通過改變溫度條件進(jìn)行甲病毒的篩選可否替代甲病毒載體上攜帶的抗性基因，從而提高核酸疫苗的安全性值得人們進(jìn)一步研究。

2.4 構(gòu)建靶向型疫苗載體 甲病毒載體的宿主范圍很廣，因此它可以在不同的細(xì)胞系中表達(dá)外源基因，而利用靶向型甲病毒載體提高甲病毒載體疫苗的作用效率。Ohno等[21]將葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合位點(diǎn)基因，插入到SIN復(fù)制子輔助質(zhì)粒(DH)結(jié)構(gòu)蛋白基因序列中。用這種輔助質(zhì)粒包裝后的復(fù)制子對(duì)大多數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率降低，卻可以靶向結(jié)合在添加了IgG單克隆抗體的細(xì)胞表面。Tseng 等[22]利用辛德畢斯病毒纖突對(duì)細(xì)胞表面層粘連蛋白的靶向結(jié)合性，僅單次腹膜內(nèi)注射攜帶了抗腫瘤基因的SIN載體，即可靶向作用于皮下、胰臟、腹膜和肺臟的大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞沒有感染能力，同時(shí)SIN復(fù)制子足以誘導(dǎo)腫瘤的完全退化。Klimstra等[23]將細(xì)菌蛋白PpL的4個(gè)免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因與SIN的結(jié)構(gòu)基因E2 的N-末端融合，使得用含該融合結(jié)構(gòu)蛋白包裝的SIN載體，也具有類似天然PpL與眾多哺乳動(dòng)物抗體IgG的Kappa輕鏈特異性結(jié)合的能力，并且能夠靶向的與Fc受體陽性細(xì)胞系結(jié)合。

3 甲病毒載體存在問題和展望

3.1 存在問題 甲病毒載體雖有許多優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在一些缺陷：（1）轉(zhuǎn)染效率比較低。復(fù)制型甲病毒載體質(zhì)粒一般在12kb左右，較大的分子量使得被轉(zhuǎn)染細(xì)胞攝入的核酸量減少，成為可能影響免疫效果的因素之一。（2）甲病毒RNA載體疫苗的不穩(wěn)定性。RNA容易降解。雖然DNA-RNA系統(tǒng)載體比甲病毒RNA復(fù)制子載體更安全、更穩(wěn)定，但是卻不能提供結(jié)構(gòu)蛋白基因，以滿足多種甲病毒載體應(yīng)用的需要，如何增強(qiáng)甲病毒RNA復(fù)制子載體的穩(wěn)定性和易操作性亟待解決。（3）被轉(zhuǎn)染細(xì)胞釋放外源蛋白病毒樣顆?？赡艽嬖诶щy。甲病毒載體快速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使得外源蛋白折疊和釋放受到影響，從而影響免疫效果。（4）靶向型載體與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的效率低。如何增加靶向型載體的結(jié)合效率成為腫瘤和疫病治療領(lǐng)域研究關(guān)注的目標(biāo)。

3.2 甲病毒載體的展望 改進(jìn)甲病毒載體的轉(zhuǎn)染方法，提高細(xì)胞的攝入率；研制開發(fā)有效的甲病毒載體包裝細(xì)胞系；在甲病毒載體中引入可調(diào)節(jié)RNA翻譯效率和增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性等順式調(diào)控元件；進(jìn)一步開發(fā)可控制表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的甲病毒載體；在結(jié)構(gòu)蛋白基因中引入更有效的靶向結(jié)合位點(diǎn)將會(huì)使甲病毒載體成為功能強(qiáng)大的基因操作工具。

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