影響小鼠胚胎時(shí)期心臟發(fā)育的相關(guān)蛋白

蔣靜綜述，都莉?qū)徯?/p>

(南昌市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330008)

小鼠胚胎發(fā)育中蛋白質(zhì)隨發(fā)育的階段、特定的組織等變遷而不斷發(fā)生變化，蘊(yùn)藏著巨大動(dòng)態(tài)的生命活動(dòng)信息，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可從分子水平了解小鼠的發(fā)育調(diào)控、發(fā)育異常等的機(jī)制。心臟是胚胎發(fā)育的重要器官之一，并且內(nèi)外環(huán)境的改變和高危因素都可能對(duì)心臟發(fā)育的威脅，其可最終導(dǎo)致多種臨床疾病，尤其是先天性心臟病。心臟疾病是發(fā)病率與死亡率均較高的一種疾病，是世界上最常見(jiàn)的死亡原因之一，嚴(yán)重地威脅著人類健康。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于心臟疾病研究，如急性冠脈綜合征、擴(kuò)張型心肌病、先天性心臟病等[1-3]疾病。下面我們探討了相關(guān)蛋白對(duì)小鼠胚胎時(shí)期心臟發(fā)育的作用。

心臟是小鼠胚胎發(fā)生過(guò)程中形成最早的器官之一，胚胎心臟發(fā)育經(jīng)過(guò)原始心管的形成和復(fù)雜的形態(tài)發(fā)生最后形成四腔室結(jié)構(gòu)的心，整個(gè)過(guò)程可人為地分為以下階段：(1)生心細(xì)胞誘導(dǎo)和特化期(E7.5d)，起源于生心板；(2)心管形成、環(huán)化期(E8.5d～E9.5d)；(3)腔室特化和生長(zhǎng)期 (E10.5d～E16.5d)；(4)心后期發(fā)育增大期(E16.5d～出生)[4]。 在心臟發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中，需要一系列重要的形態(tài)發(fā)生事件，包括細(xì)胞決定、細(xì)胞遷移和細(xì)胞分化等[5]。小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中其各種轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)化因子、細(xì)胞骨架蛋白及細(xì)胞凋亡等眾多基因及蛋白在不同時(shí)間上的順序表達(dá)以保證胚胎心臟形成在時(shí)間和空間上的協(xié)調(diào)性。

1 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)小鼠胚胎心臟發(fā)育的影響

心臟特異轉(zhuǎn)錄因子主要是指在心肌細(xì)胞中表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄活化因子，并且調(diào)控編碼心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白或調(diào)節(jié)蛋白的心臟基因的表達(dá)。單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子并不能完全控制心臟的生長(zhǎng)發(fā)育，而是由心臟特異及廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的特定組合，如鋅指蛋白GATA4、同源域蛋白Nkx2.5和Thxs以及MADShox蛋白血清反應(yīng)因子 (SRF)等綜合作用，從而體現(xiàn)了不同的生理過(guò)程。

1.1 同源結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)錄因子

1.1 .1 Nkx2.5 Nkx2.5含同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活因子，同源結(jié)構(gòu)域有一個(gè)螺旋一折疊一螺旋的模體，結(jié)合于保守DNA序列T(C/T)AAGTG。在小鼠胚胎7.5d時(shí)心臟CSX/Nkx2.5即開(kāi)始表達(dá)，主要表達(dá)于心臟生成板內(nèi)胚和中胚層、咽部中胚層和內(nèi)臟中胚層等，是心臟最早特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一[6]。傳統(tǒng)的Nkx2.5基因敲除小鼠顯示了早期胚胎致死和心管彎曲障礙，與已知的心臟同源盒基因在心臟發(fā)生早期的作用相吻合[7]。Nkx2.5缺失的小鼠心肌幾乎不發(fā)育，心臟結(jié)構(gòu)停滯在心管彎曲后的初始階段。在Nkx2.5功能異常的小鼠胚胎心臟中，一些心臟基因表達(dá)降低，包括MLC2v，ANP，BNP，CARP，MEF2C，Ehand，N-myc，Ixr4 和 HOP[8]，Nkx2.5也參與了Pitx2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體上。

1.1 .2 Irx4(Iroquois homeobox gene4)Irx4屬于含有同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的Iroquois家族，為心室特異性同源盒基因，Irx4在整個(gè)發(fā)育階段均在心室細(xì)胞特異表達(dá)。lrx4參與了肌球蛋白重鏈基因(MHC)在心室肌細(xì)胞特異表達(dá)的正調(diào)控和負(fù)調(diào)控。lrx4并不是心室特異性基因表達(dá)的全局調(diào)控因子，因?yàn)槠茐男∈蟮膌rx4僅干擾部分心室特異性基因的表達(dá)，包括減少eHAND在胚心中的表達(dá)和出生后心房肽(AN)在心房中去阻遏。Irx4缺陷小鼠心功能減弱最終發(fā)展成心肌病，這強(qiáng)調(diào)了維持正常的腔室特異性基因表達(dá)對(duì)正常心功能的重要性[9，10]。

1.1 .3 pitx2 pitx2是成對(duì)同源域蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，其主要功能是參與調(diào)控心房發(fā)育的不對(duì)稱特征。缺乏pitx2的小鼠只有一個(gè)右心房形狀的大心房，與下腔靜脈及肺靜脈連接異常。但最近研究顯示：轉(zhuǎn)錄因子pitx2沿著早期心管的左側(cè)表達(dá)，參與了介導(dǎo)從左到右的信號(hào)通路。從左到右傳導(dǎo)缺陷的小鼠模型表現(xiàn)了缺失，雙側(cè)對(duì)稱或者逆轉(zhuǎn)的pitx2的表達(dá)[11]。

1.2 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子

1.2 .1 GATA家族 GATA家族是一類鋅指蛋自轉(zhuǎn)錄因子，具有結(jié)合核酸共同序列w/GATA/R的特性，進(jìn)化上非常保守。GATA家族成員在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化方面起重要作用，目前有GATA4/5/6三個(gè)成員在心臟中表達(dá)[12]。GATA4/5/6在心肌分化過(guò)程中的表達(dá)暗示其可能與心內(nèi)膜、心肌和大血管的形成有關(guān)。GATA4是心臟發(fā)育過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，是胚胎發(fā)育過(guò)程中心臟細(xì)胞的早期標(biāo)志。小鼠胚胎在E7.0d～7.5d時(shí)，GATA4可以的中胚層祖細(xì)胞中最早檢測(cè)到，心管的形成密切相關(guān)。GATA4缺失的小鼠胚胎內(nèi)胚層細(xì)胞不能正常分化，腹側(cè)遷移受阻，致心臟二分裂[13]，表明GATA4參與心臟中多種組分的發(fā)育。轉(zhuǎn)錄因子GATA4是心臟發(fā)生調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的蛋白，調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化增生及心臟的形態(tài)發(fā)生過(guò)程[14-16]。GATA5主要在心內(nèi)膜細(xì)胞中表達(dá)，被認(rèn)為是心臟形成途徑中的看家調(diào)節(jié)因子，其與下游基因Nkx2.5一起促進(jìn)許多成心臟基因表達(dá)。GATA5在Nkx2.5及其它心臟基因的表達(dá)、正常數(shù)量的心肌前體細(xì)胞的形成、心肌及心內(nèi)膜形成、心室腔的分化等心臟發(fā)育方面，起到極其重要作用[17]。GATA6在中胚層表達(dá)，隨后可在心肌及血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，在早期發(fā)育階段調(diào)節(jié)心肌前體細(xì)胞增殖。

1.2 .2 FOG-2 FOG-2為鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子與心臟間隔有關(guān)，小鼠缺失FOG-2不會(huì)引起細(xì)胞的增殖，而是出現(xiàn)類似于法樂(lè)氏四聯(lián)癥的房室間隔缺損并且伴隨冠狀血管形成障礙。在FOG-2缺失小鼠中強(qiáng)制表達(dá)FOG-2可彌補(bǔ)心臟和血管缺損，提示FOG-2在心臟內(nèi)的靶分子可能是冠狀血管形成的信號(hào)[18]。

1.3 Tbox轉(zhuǎn)錄因子

1.3 .1轉(zhuǎn)錄因子Tbox1 Tbox1轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育過(guò)程中，參與胚胎早期咽弓動(dòng)脈的形成，神經(jīng)嵴細(xì)胞的正確遷移和心臟流出道的形成Tbox1是調(diào)控心臟發(fā)育的主要的轉(zhuǎn)錄因子。Tbox1基因的突變或缺失會(huì)導(dǎo)致不同類型的心臟發(fā)育異常。

1.3 .2轉(zhuǎn)錄因子Tbox5 Tbox5最初在整個(gè)心臟中胚層都有表達(dá)，在前晚期線形心管形成期梯度表達(dá)，直到妊娠中期，只在心房和左心室表達(dá)[19]，對(duì)房室腔的初始分化和間隔的形成也具有重要作用，并且是手-心綜合征的致病基因。在Tbox5缺陷的小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，其連接蛋白表達(dá)降低。它可能發(fā)揮雙重作用：破壞發(fā)育中的傳導(dǎo)系統(tǒng)正常的空間構(gòu)型，破壞在傳導(dǎo)系統(tǒng)的細(xì)胞自主效應(yīng)。

1.3 .3轉(zhuǎn)錄因子Tbox18轉(zhuǎn)錄因子Tbox18是T-box家族的成員之一，是新的祖細(xì)胞標(biāo)記因子，具有誘導(dǎo)多向分化潛能，對(duì)小鼠胚胎期多種器官的發(fā)育起重要作用，特別是對(duì)胚胎期心臟的發(fā)育作用尤為突出。有研究發(fā)現(xiàn)[20]：在E9.5d和E10.5d的小鼠胚胎含轉(zhuǎn)錄因子Tbox18的細(xì)胞最初在前體心外膜表達(dá)，逐漸向心外膜區(qū)域遷移；大于E11.5d的胚胎心臟也有明確而特異地Tbox18表達(dá)，表明轉(zhuǎn)錄因子Tbox18是小鼠胚胎前體心外膜的早期標(biāo)志之一，對(duì)小鼠心臟的發(fā)育有重要作用。

1.4 其他轉(zhuǎn)錄因子 有研究表明，組蛋白乙?；?p300)/CREB結(jié)合蛋白(CBP)對(duì)胚胎心發(fā)育有重要作用[21，22]；p300對(duì)整個(gè)胚胎心發(fā)育尤其是發(fā)育早期的生心細(xì)胞誘導(dǎo)特化和中期的室間隔形成作用更大。p300和CBP是轉(zhuǎn)錄共激活因子，在胚胎心發(fā)育過(guò)程中，它們通過(guò)調(diào)控胚胎心肌細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因而起作用[23]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Pax基因表達(dá)的蛋白，它們?cè)谂咛グl(fā)育過(guò)程中對(duì)組織和器官的分化起著重要的調(diào)控作用，與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

胰島素基因增強(qiáng)子結(jié)合蛋白l(Islet-1)是LIMHD蛋白中與心臟相關(guān)的亞型，是心肌祖細(xì)胞的標(biāo)志之一。也是心臟發(fā)育核心轉(zhuǎn)錄因子中的關(guān)鍵因子。有報(bào)道指出[24]：轉(zhuǎn)錄因子Islet-1可以與p300結(jié)合，以蛋白復(fù)合物的形式存在，提示轉(zhuǎn)錄因子Islet-1可能作為樞紐因子募集HATs亞型p300，介導(dǎo)組蛋白乙?；揎棇?duì)心臟發(fā)育相關(guān)基因GATA4、MEF2C和TBX5調(diào)控作用。

ISL-1是第二生心區(qū)主要的標(biāo)志蛋白，在心管早期發(fā)育過(guò)程中，ISL-1和FGF、BMP、SHH等多種細(xì)胞信號(hào)及轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控第二生心區(qū)的發(fā)育、增生和細(xì)胞特異性的保持[25,26]。

有研究發(fā)現(xiàn)[27]：大鼠胚胎E15d，HCN4基因在蛋白水平及mRNA的變化在心房和心室均高表達(dá)，此后隨胚胎心臟的發(fā)育逐漸下降，至P10d后接近成年低表達(dá)水平。提示HCN4在心臟不同發(fā)育階段的作用不同[28]：胚胎HCN4是真正的起搏因子，成年小鼠HCN4通道的作用可能是參與普通心肌收縮與防止竇性傳導(dǎo)阻滯。

2 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子對(duì)小鼠胚胎心臟發(fā)育的影響

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)是一種具有多功能活性的生長(zhǎng)因子。在胚胎發(fā)育期，TGF-β家族參與了早期心前體細(xì)胞特化，環(huán)狀心形成，心內(nèi)膜表皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，心外膜表皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程[29,30]。許多研究認(rèn)為：TGFβs通過(guò)特異的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體介導(dǎo)發(fā)揮其生物學(xué)功能，在胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中參與上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)心肌特異性肌球蛋白的表達(dá)和心肌細(xì)胞的增生和分化[31]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFβs及其受體TβRⅠ和TβRⅡ是胚胎組織和器官發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子，可以促進(jìn)發(fā)育中胚胎心臟心肌特異性蛋白質(zhì)如：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白，α-肌球蛋白重鏈和β-肌球蛋白重鏈的表達(dá)，在心內(nèi)膜墊的形成和心臟的分隔過(guò)程中起重要誘導(dǎo)作用[32，33]。其中，α-SMA和結(jié)蛋白在小鼠胚胎心臟表達(dá)的時(shí)空差異性表明小鼠胚胎心臟不同部位發(fā)育成熟的時(shí)間有差異，右心室成熟較慢。α-SMA表達(dá)可能與早期胚胎心臟的緩慢蠕動(dòng)收縮有關(guān)，而肌節(jié)的發(fā)育成熟需要較高的結(jié)蛋白表達(dá)[34]。

3 細(xì)胞骨架蛋白對(duì)小鼠胚胎心臟發(fā)育的影響

縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)是構(gòu)成哺乳動(dòng)物心臟縫隙連接最主要的連接蛋白，為心肌細(xì)胞問(wèn)通訊提供代謝偶聯(lián)和電偶聯(lián)[35]。主要分布在工作心肌和周圍傳導(dǎo)系心肌，在維持工作心肌與周圍傳導(dǎo)系統(tǒng)的興奮和傳導(dǎo)等方面起重要作用。在胚胎E9.5d時(shí)，細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43在心臟中開(kāi)始表達(dá)，對(duì)于心臟的正常形態(tài)發(fā)生起著極其重要的作用。對(duì)Cx43基因敲除小鼠研究表明，Cx43基因敲除純合小鼠心臟發(fā)育畸形[36]，雜合小鼠心臟結(jié)構(gòu)正常，但表現(xiàn)出心室心律失常。在人類，Cx43基岡突變與先天性心臟病密切相關(guān)[37]。

Nesprins(Nuclear envelop spectrin repeat)是細(xì)胞骨架蛋白家族的新成員，是英國(guó)劍橋大學(xué)醫(yī)學(xué)系Dr.Zhang等用差異cDNA篩選和同源檢索尋找血管平滑肌細(xì)胞分化標(biāo)記物過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由兩個(gè)基因編碼的II型完整核膜蛋白[38-40]。Nesprin-1蛋白在心臟發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均分布在核被膜和核周間隙，在心臟發(fā)育過(guò)程中Nesprin-1蛋白無(wú)遷移現(xiàn)象。推測(cè)核被膜蛋白Nesprin-1可能與胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育以及收縮功能密切相關(guān)。Nesprin-2是Nesprins家族的一個(gè)蛋白亞型。研究發(fā)現(xiàn)14q23染色體異常可導(dǎo)致致心律失常性右室發(fā)育不良 (Arrhythmogenic right ventricular dysplasia，ARVD)[41，42]。 Nesprin-2 在 E12.5d 表達(dá)最高，隨著心臟發(fā)育呈現(xiàn)逐漸下調(diào)的趨勢(shì)，這一動(dòng)態(tài)變化可能與心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)。

韌黏素(TN)是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，Imanaka-Yoshida等[43]研究表明TN-C在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中的心肌細(xì)胞分化、原始心管扭轉(zhuǎn)、心包腔形成房室間隔形成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。心臟胚胎時(shí)期發(fā)生發(fā)育主要受WNT[44]、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bonemorphogenetic protein,BMP)[45]、Notch[46]等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控。BMP與Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在胚胎心臟早期發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用。其中，骨形態(tài)形成蛋白受體IA(bonemorphogenetic protein receptor IA,BMPR IA，又名ALK3)在心臟發(fā)育及心肌細(xì)胞的分化中起重要作用，并與室間隔缺損形成有關(guān)。

4 細(xì)胞凋亡對(duì)小鼠胚胎心臟發(fā)育的影響

細(xì)胞凋亡對(duì)于胚胎各器官的正常生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，而凋亡異常是導(dǎo)致胚胎異常發(fā)育的重要因素。一旦發(fā)生凋亡紊亂將導(dǎo)致胚胎結(jié)構(gòu)和功能的異常,甚至導(dǎo)致胚胎的死亡及心臟的異常發(fā)育。細(xì)胞凋亡是一個(gè)多步驟并且受基因調(diào)控的過(guò)程，其包含Bcl-2家族蛋白的調(diào)控和caspese的激活，絲氨酸蛋白酶也可能參與這一機(jī)制。有文獻(xiàn)報(bào)道[47]：小鼠心臟的發(fā)育過(guò)程中：p53和Bax表達(dá)趨勢(shì)具有一致性，在E11d~E13d表達(dá)較弱，表明此時(shí)心臟細(xì)胞可能主要處于增殖或者是分化時(shí)期。E14d時(shí)p53和Bax表達(dá)快速增加，達(dá)到高峰，且主要分布于心腔側(cè)，結(jié)合HE染色組織學(xué)觀察到此時(shí)為心臟體積迅速增大期，此時(shí)心在體積增大的同時(shí)也是心腔壁細(xì)胞大量凋亡、清除多余的細(xì)胞，使管腔體積不斷增大的時(shí)期，為心臟的功能分化作準(zhǔn)備，是心臟塑形關(guān)鍵時(shí)期。由此可見(jiàn)，細(xì)胞凋亡對(duì)心臟的正常發(fā)育也發(fā)揮一定的作用。

5 妊娠糖尿病對(duì)小鼠胚胎心臟發(fā)育的影響

糖尿病的孕婦子代畸形發(fā)生率很高，最常見(jiàn)之一是心臟畸形[48]。有研究表明[49]：高血糖組無(wú)論是外觀正常還是畸形胚胎Pax3基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著降低，Cx43基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著升高，說(shuō)明高血糖引起了Pax3及Cx43基因水平表達(dá)的改變，并引起蛋白質(zhì)水平的改變，從而導(dǎo)致畸形的發(fā)生。

胚胎發(fā)育各器官蛋白質(zhì)表達(dá)差異，使胚胎的器官結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)生了一系列的變化，也更進(jìn)一步說(shuō)明了蛋白質(zhì)與胚胎器官的發(fā)育是密切相關(guān)的，通過(guò)這些研究大大加深了人們對(duì)胚胎發(fā)育的認(rèn)識(shí)。心臟發(fā)育是一復(fù)雜的過(guò)程，涉及許多蛋白質(zhì)的參與。心臟疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的整體、動(dòng)態(tài)、網(wǎng)絡(luò)研究將直接從蛋白質(zhì)水平來(lái)探討心臟疾病發(fā)生過(guò)程中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量變化，從而闡明心臟疾病的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，為心臟疾病治療提供新手段和思路。同時(shí)，為我們了解人類心臟發(fā)育相關(guān)蛋白的研究提供了基礎(chǔ)，這將有利于人類生殖健康，提高人口素質(zhì)，進(jìn)一步為人類的優(yōu)生打下基礎(chǔ)。

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