聯(lián)合檢測(cè)GP-73和GPC3及AFP-L3在早期肝癌中的診斷價(jià)值

葉迎賓 黃秀香 李軍 章健 田楠楠 王秀芹 趙斗貴

原發(fā)性肝癌(PHC)在我國已成為第二惡性腫瘤，有56%的癌癥患者為肝癌。普遍認(rèn)為肝癌的發(fā)生是一個(gè)包括癌基因激活和抑癌基因失活的多因素、多步驟過程［1］。但關(guān)于肝癌的確切病因尚不清楚。在我國主要以病毒性肝炎(HBV、HCV)的慢性持續(xù)感染是肝癌發(fā)生的主要背景，乙型肝炎相關(guān)者占70% ～80%，丙型與丁型肝炎相關(guān)者為15% ～20%［2］。約5%的肝癌可能與黃曲霉毒素、飲用水污染、遺傳因素等有關(guān)［2］。往往當(dāng)發(fā)現(xiàn)肝癌時(shí)，大多錯(cuò)過最佳的治療時(shí)間，如何能及早發(fā)現(xiàn)肝癌呢?當(dāng)務(wù)之急就是要找到一種對(duì)肝癌細(xì)胞靈敏度和特異性高的標(biāo)志物［如甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、高爾基體糖蛋白73(GP-73)］。本文通過對(duì)肝癌患者的AFP-L3、GPC3、GP-73的檢測(cè)數(shù)據(jù)的分析，探討三者聯(lián)合檢測(cè)來診療肝癌的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年5月至2012年12月，在我院肝病科住院且經(jīng)病理學(xué)或符合AFP診斷標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)的肝癌患者154例(肝癌組)，其中男95例，女59例;年齡36～76歲，平均年齡53.9歲。肝硬化患者78例(肝硬化組)，其中男56例，女22例;年齡30～66歲，平均年齡48.3歲。肝硬化患者診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》［3］中肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)。肝癌診斷符合原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)［4］。正常體檢者56例為對(duì)照組，其中男39例，女17例;年齡20～36歲，平均年齡25.4歲。

1.2 儀器與試劑 儀器為Thermo公司的 MK3酶標(biāo)儀(簡(jiǎn)稱“酶標(biāo)儀”);AFP-L3、GPC3、GP-73試劑盒均由上海雅吉生物科技有限公司提供。檢測(cè)AFP的儀器為西安核儀器廠提供的XH-6080十探頭全自動(dòng)智能γ免疫計(jì)數(shù)器，其試劑盒有北京北方生物技術(shù)研究所提供，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3 檢測(cè)方法 取被檢者空腹靜脈血5 ml，分離血清，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。AFP-L3、GPC3、GP-73三者檢測(cè)均采用ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。用酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線圖，分別計(jì)算出其濃度。AFP檢測(cè)采用放射免疫法，AFP＞20 μg/L，AFP-L3% ＞10%視為陽性;GPC3檢測(cè)值 ＞3.0 μg/L 視為陽性;GP-73 檢測(cè)值 ＞150 μg/L 視為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用采用t檢驗(yàn)(LSD)。繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)來確定最佳臨界值，計(jì)算ROC曲線下的面積(AUG)，采用單樣本t檢驗(yàn)比較AUG、敏感度和特異度，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組中血清 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 含量以及AFP-L3/AFP比較 PHC組血清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與肝硬化組和對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。3組中相同項(xiàng)目?jī)蓛杀容^，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 3 組血清中 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 含量以及AFP-L3/AFP±s

表1 3 組血清中 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 含量以及AFP-L3/AFP±s

注:與肝癌組比較，*P ＜0.01;與肝硬化組比較，#P ＜0.01

組別 AFP(μg/L) GP-73(μg/L)GPC3(μg/L) AFP-L3(μg/L)AFP-L3/AFP(%)肝癌組(n=154) 2 124±2 183 174±54 10.7±3.1 338.6±379.2 13.8±4.0肝硬化組(n=78) 84±49* 82±36* 2.7±0.7* 6.4±2.8* 8.8±3.9*對(duì)照組(n=56) 11±6*# 17±13*# 1.3±0.6*# 0.7±0.6*# 6.3±2.7*#F值63.1 266.9 411.1 56.3 126.8 P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 GP-73、GPC3和 AFP-L3三者聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果

GP-73、GPC3和AFP-L3三者中有一項(xiàng)為陽性即為聯(lián)合檢測(cè)陽性(并聯(lián)實(shí)驗(yàn))，敏感度97.9%(282/288)，特異度 79.5%(105/132)，準(zhǔn)確度 87.5%(387/442)。三者的敏感度和準(zhǔn)確度高于任何兩者聯(lián)合和單項(xiàng)的敏感度和準(zhǔn)確度(P＜0.05)，特異度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 GP-73、GPC3和AFP-L3單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PHC的診斷價(jià)值比較 %(例)

2.3 血清 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 的含量對(duì) PHC的診斷價(jià)值 以AFP-L3＞10%為判斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)ROC曲線結(jié)果，以診斷PHC的靈敏度與特異度之和的最高值確定臨界值，血清 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3診斷PHC 的臨界值分別為 1 255.0、162.5、9.7 和 119.2。見圖1、表3。

圖1 AFP、GP-73、GPC-3和AFP-L3檢測(cè)診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線

表3 GP-73、GPC-3和AFP-L3檢測(cè)對(duì)PHC的診斷價(jià)值 %(例)

2.4 不同AFP水平的肝癌組的GP-73、GPC3、AFP-L3的陽性變化 GP-73在肝癌組不同AFP水平的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AFP-L3(%)在肝癌組不同AFP水平的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。GPC3的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表4。

表4 不同AFP水平在肝癌組中GP-73、GPC3、AFP-L3%的陽性率

3 討論

AFP是目前臨床上最主要、應(yīng)用最廣泛的PHC早期篩查血清標(biāo)志。但是有1/3的慢性肝病、肝纖維化和肝硬化出現(xiàn)AFP不同程度的升高，有1/3的PHC患者不升高［5］。導(dǎo)致AFP的敏感度和特異度不高，不能滿足臨床需要。由于不同研究的設(shè)計(jì)方案不同、樣本量差異、AFP臨界值設(shè)定不同等多方面原因造成敏感性有差異［6］。本文以AFP-L3% ＞10%為標(biāo)準(zhǔn)，AFP診斷PHC的臨界值為1 255.0 μg/L，遠(yuǎn)大于參考區(qū)間(0～20 μg/L)，敏感度為48.1%，特異度為100%?？赡芘c標(biāo)本的收集或者檢測(cè)方法有直接關(guān)系，有待進(jìn)一步論證。

AFP-L3為肝癌細(xì)胞特異產(chǎn)生，表達(dá)AFP-L3的肝癌細(xì)胞有早期血管浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的傾向，ALF-L3%(AFP-L3/AFP)越高提示腫瘤的惡性程度越高［7］。丁賢等［8］報(bào)道，表明AFP-L3用于肝癌的診斷不受AFP≥400 μg/L作為肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)的限制，當(dāng)AFP-F3%＞10%而AFP輕度升高提示發(fā)生肝癌的可能性較大。由于AFP-L3%不受AFP水平的影響，因此檢測(cè)AFPL3%是AFP低濃度持續(xù)陽性患者及小肝癌AFP尚未明顯升高時(shí)早期預(yù)報(bào)肝癌發(fā)生的重要指標(biāo)［9］。何建偉等［10］報(bào)道AFP-L3%非常適用于PHC和肝硬化鑒別診斷，同時(shí)也適用低濃度AFP持續(xù)陽性的良、惡性肝病的鑒別診斷。從表4中得知，肝癌組中隨著AFP水平越高AFP-L3%的陽性(59.1%)率越高，與其他3個(gè)水平相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.842，P=0.000)。在PHC和肝硬化的鑒別診斷，ALP-L3運(yùn)用具有明顯的優(yōu)勢(shì)(F=126.8，P=0.000)。

GPC3是一類細(xì)胞表面的糖蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和遷移等行為，在機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育中起著重要的作用［11］。2010年7月由 Bruix等［12］共同指出，小病灶的肝活組織病理學(xué)檢查不能確認(rèn)為HCC的組織，應(yīng)用所有可用標(biāo)志物之一的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3進(jìn)行染色，以提高診斷準(zhǔn)確性。宋孟锜等［13］指出，GPC3在肝癌組織表達(dá)高于癌旁和正常肝組織，GPC3與腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、HBsAg及AFP水平無明顯相關(guān)，而與病理分級(jí)和臨床分期有關(guān)。到目前為止，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，PHC組的GPC3明顯高于肝硬化組和正常對(duì)照組，與后者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=411.1，P＜0.01)。雖然 GPC3隨 AFP的水平升高而陽性率增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.222，P＞0.05)。文獻(xiàn)多次報(bào)道提示臨床要慎重對(duì)待高于正常肝組織的GPC3的檢測(cè)值，要科學(xué)合理地進(jìn)行檢查，防止漏檢，進(jìn)而提高肝癌的診治率［14－16］。

GP-73是存在于高爾基體的一種跨膜糖蛋白，在正常的人體肝組織中主要由膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，而肝細(xì)胞表達(dá)很少甚至不表達(dá)。在急、慢性肝炎或肝硬化中，GP-73表達(dá)明顯升高［17］。本實(shí)驗(yàn)中，肝癌組明顯高于肝硬化組和正常對(duì)照組(F=266.9，P＜0.01)，與曾經(jīng)的文獻(xiàn)報(bào)道［18－20］一致。在AFP不同水平中肝癌組的GP73陽性率高于肝硬化組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.977，P＜0.033)，說明血清中GP73的濃度與AFP的水平有關(guān)，這與Sun等［21］報(bào)道不同，后者指出血清GP73與腫瘤大小、分化程度無相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可降低有單一標(biāo)志物所致的漏診和誤診，能有效提高診斷的準(zhǔn)確率，彌補(bǔ)單項(xiàng)的不足［22，23］。檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三者聯(lián)合檢測(cè)GP-73、GPC3和 AFP-L3%的敏感度(97.9%)和準(zhǔn)確度(87.5%)較單獨(dú)檢測(cè)或任兩項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但特異度較低。聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肝癌早期診斷及AFP陰性肝癌的篩選有很多的臨床意義，也有助于良惡性肝病的鑒別［24］。房萌等［5］報(bào)道GP-73在肝硬化中顯著上升，作為PHC診斷標(biāo)志應(yīng)需臨床大量標(biāo)本進(jìn)一步驗(yàn)證。馬桂英等［25］研究顯示有27.7%的良性肝病患者血清AFP水平也可增高，故僅檢測(cè)AFP易造成漏診和誤診。從表4中顯示，GP-73和AFP-L3在肝癌組不同AFP水平的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng) AFP≤400 μg/L不能確診肝癌時(shí)，可以檢測(cè) GP-73、GPC3和AFP-L3對(duì)AFP的不足做出彌補(bǔ)，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早治療的效果。GP-73、GPC3和AFP-L3在肝癌中的含量明顯高于肝硬化組，這說明肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化的過程中，定期觀察標(biāo)志物的濃度變化對(duì)肝癌早期的判斷提供重要的依據(jù)。

總之，肝癌是一種復(fù)雜性的疾病，單一的高特異性和敏感性的生物標(biāo)志物不可能檢測(cè)所有的肝癌患者［26］。多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物能提高原發(fā)性肝癌的診斷率，因此我們要通過大量試驗(yàn)組合的分析，發(fā)現(xiàn)具有高敏感度和高特異度的新型腫瘤標(biāo)志物用于對(duì)早期肝癌的鑒別診斷。

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