氨基樹脂固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究

尹春麗，曹珊珊，許　樂，陶貴榮，牛衛(wèi)寧

(1.西安文理學(xué)院生命科學(xué)系，陜西 西安710065；2.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西 西安 710072)

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)作為藥品和保健品已得到廣泛應(yīng)用[1-2]，其制備方法主要有酵母菌發(fā)酵法和體外酶促轉(zhuǎn)化法。與酵母菌發(fā)酵法相比，體外酶促轉(zhuǎn)化法合成SAM具有生產(chǎn)周期短、底物轉(zhuǎn)化率高、純化工藝簡單以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景[3]。目前，體外酶促轉(zhuǎn)化法合成SAM需要解決的關(guān)鍵問題是大量廉價SAM合成酶的獲得以及選擇合適的載體固定化SAM合成酶，以大幅提高固定化酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用批次。

作者在前期研究中構(gòu)建了組成型表達(dá)SAM合成酶的重組大腸桿菌[4]，并對SAM合成酶進(jìn)行了固定化研究。結(jié)果表明，通過海藻酸鈣包埋法和殼聚糖-戊二醛交聯(lián)法得到的固定化酶的機(jī)械強(qiáng)度較低，重復(fù)使用過程中容易破碎[5-7]。而Luo等[8]使用鎳離子親和層析介質(zhì)固定的釀酒酵母SAM合成酶也存在酶活力回收率低以及固定化酶重復(fù)使用批次少等不足。

氨基樹脂作為一種人工合成的多聚物，具有機(jī)械強(qiáng)度高、酶載量大等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛用作固定化酶載體[9-10]。作者使用氨基樹脂載體對SAM合成酶進(jìn)行了固定化研究,優(yōu)化了酶的固定化條件并對固定化酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期開發(fā)適用于工業(yè)化應(yīng)用的固定化酶，為酶法工業(yè)化生產(chǎn)SAM奠定基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　菌種、材料與試劑

重組大腸桿菌E.coliJM109(pBR322-SAMS)，本研究室構(gòu)建[4]。

苯基瓊脂糖凝膠預(yù)裝柱(Phenyl-Sepharose Fast Flow)，美國GE公司；Seplite LX-1000HA型氨基樹脂，西安藍(lán)曉科技有限公司。

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2　SAM合成酶液的制備

SAM合成酶的表達(dá)和純化參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，步驟如下：

大腸桿菌E.coliJM109(pBR322-SAMS)在含有15μg·mL-1四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中30 ℃過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期，離心收集菌體并超聲破碎細(xì)胞，破碎上清液加入0.75 mol·L-1硫酸銨進(jìn)行鹽析沉淀；離心后上清液再經(jīng)過苯基瓊脂糖凝膠預(yù)裝柱疏水層析，緩沖溶液(50 mmol·L-1Tris-HCl,pH值8.0)洗脫得到SAM合成酶液，酶活力為32 U·mg-1。

1.3　SAM合成酶的固定化

去離子水洗滌氨基樹脂3次，加入不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛水溶液，室溫振蕩交聯(lián)5 h，去離子水充分洗滌交聯(lián)載體；然后加入適量純化的SAM合成酶液，在室溫(25 ℃，下同)下吸附交聯(lián)，棄去上清液，去離子水洗滌3次，抽濾后得到固定化SAM合成酶，4 ℃保存。

1.4　固定化SAM合成酶催化合成SAM

在5 mL SAM合成反應(yīng)液(100 mmol·L-1Tris-HCl、100 mmol·L-1KCl、40 mmol·L-1MgSO4、26 mmol·L-1L-Met、20 mmol·L-1ATP、0.6 mol·L-1對甲基苯磺酸鈉，pH值7.0)中加入0.5 g固定化SAM合成酶,35 ℃搖床振蕩反應(yīng)8 h，高效液相色譜(HPLC)分析反應(yīng)液SAM濃度。反應(yīng)后將固定化酶洗滌重復(fù)使用。

1.5　酶活力的測定

酶活力的測定參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

酶活力單位(U)定義為：37 ℃下，1 h催化形成1μmol SAM所需要的酶量。

酶活力回收率定義為：固定化酶的總活力與固定化前游離酶總活力的比值。

2　結(jié)果與討論

2.1　SAM合成酶固定化條件的優(yōu)化

2.1.1戊二醛體積分?jǐn)?shù)對SAM合成酶固定化的影響

用不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛水溶液10 mL在室溫下處理0.5 g氨基樹脂5 h，抽濾洗滌后加入2 mg·mL-1SAM合成酶液10 mL，室溫交聯(lián)8 h，測定固定化酶酶活力及酶活力回收率，結(jié)果如圖1所示。

圖1　戊二醛體積分?jǐn)?shù)對固定化酶酶活力及酶活力回收率的影響

由圖1可知，當(dāng)戊二醛體積分?jǐn)?shù)為5 %時，固定化酶酶活力及酶活力回收率達(dá)到最大值。戊二醛體積分?jǐn)?shù)與氨基樹脂表面醛基的含量正相關(guān)，樹脂表面偶聯(lián)的醛基較少時，固定的酶量不足，導(dǎo)致固定化酶酶活力較低；偶聯(lián)的醛基過多時，可導(dǎo)致SAM合成酶變性。因此，最佳戊二醛體積分?jǐn)?shù)為5 %。

2.1.2酶添加量(酶與樹脂的比例，mg·g-1，下同)對SAM合成酶固定化的影響

將經(jīng)過戊二醛處理的氨基樹脂0.5 g與不同添加量的SAM合成酶液交聯(lián)反應(yīng)8 h，測定固定化酶酶活力與酶活力回收率，結(jié)果如圖2所示。

圖2　酶添加量對固定化酶酶活力及酶活力回收率的影響

由圖2可知，當(dāng)SAM合成酶添加量大于20 mg·g-1時，固定化酶酶活力趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加酶量，固定化酶酶活力不再顯著增加；而酶活力回收率卻大幅下降。這是由于載體表面的醛基結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)趨于飽和。因此，最佳酶添加量為20 mg·g-1。

2.1.3固定化時間對SAM合成酶固定化的影響

將經(jīng)過戊二醛處理的氨基樹脂0.5 g與5 mL 2 mg·mL-1SAM合成酶液在室溫下交聯(lián)反應(yīng)一定時間，測定固定化酶酶活力及酶活力回收率，結(jié)果如圖3所示。

圖3　固定化時間對固定化酶酶活力及酶活力回收率的影響

由圖3可知，當(dāng)固定化時間為5 h時,固定化酶酶活力達(dá)到最大值476.8 U·g-1，酶活力回收率為74.5%。繼續(xù)延長固定化時間，固定化酶酶活力及酶活力回收率開始緩慢下降,這可能是由于載體表面交聯(lián)的酶量過大，導(dǎo)致反應(yīng)底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)性降低。因此，最佳固定化時間為5 h。

2.2　固定化SAM合成酶的性質(zhì)

2.2.1熱穩(wěn)定性

將游離和固定化SAM合成酶在不同溫度下孵育5 h后測定并計算相對酶活力，結(jié)果如圖4所示。

圖4　游離和固定化SAM合成酶的熱穩(wěn)定性

由圖4可知，相對于游離SAM合成酶，固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯提高；在50 ℃下孵育5 h固定化酶酶活力仍保留了61.2%，而游離酶則完全失活。表明氨基樹脂固定化SAM合成酶的熱穩(wěn)定性與殼聚糖固定化SAM合成酶相似[7]，但明顯高于海藻酸鈣包埋法固定的SAM合成酶[5]。

2.2.2pH值穩(wěn)定性

將游離和固定化SAM合成酶在不同pH值緩沖溶液中4 ℃保存12 h后測定并計算相對酶活力，結(jié)果如圖5所示。

圖5　pH值對游離和固定化SAM合成酶穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，固定化SAM合成酶在pH值8.0的緩沖溶液中最穩(wěn)定，而游離酶在pH值7.5的緩沖溶液中最穩(wěn)定；在pH值為7.0～7.5的緩沖溶液中，游離SAM合成酶的穩(wěn)定性略高于固定化酶，在pH值為6.0～6.5、8.0～9.5的緩沖溶液中固定化SAM合成酶的穩(wěn)定性均明顯高于游離酶。這可能是因?yàn)椋副还潭ㄔ跇渲?，其?gòu)象變得更加剛性和穩(wěn)定，導(dǎo)致緩沖溶液pH值對酶活力的影響減弱。

2.2.3米氏常數(shù)(Km)

2.2.4操作穩(wěn)定性

將固定化SAM合成酶連續(xù)催化反應(yīng)10批次，每批次反應(yīng)后測定并計算相對酶活力，結(jié)果如圖6所示。

圖6　固定化SAM合成酶的操作穩(wěn)定性

由圖6可知，隨著反應(yīng)批次的增加，固定化SAM合成酶酶活力逐漸下降，連續(xù)反應(yīng)10批次后，酶活力保留86.3%；而殼聚糖固定化SAM合成酶連續(xù)催化反應(yīng)5批次后，酶活力僅殘留64%[7]。表明氨基樹脂固定化SAM合成酶具有更優(yōu)的操作穩(wěn)定性。

2.2.5儲存穩(wěn)定性

將游離和固定化SAM合成酶在4 ℃冰箱中分別保存15 d和30 d后測定保留酶活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：游離SAM合成酶保存15 d后酶活力僅保留14.6%，保存30 d后檢測不到酶活力；而固定化SAM合成酶保存15 d和30 d后酶活力仍保留92.6%和 81.4%。表明氨基樹脂固定化SAM合成酶的儲存穩(wěn)定性得到大幅提高，并且優(yōu)于殼聚糖固定化SAM合成酶[7]。

3　結(jié)論

以氨基樹脂為載體對SAM合成酶進(jìn)行固定化。優(yōu)化的固定化條件為：戊二醛體積分?jǐn)?shù)5%、SAM合成酶添加量20 mg·g-1、固定化時間5 h。所制備的固定化SAM合成酶連續(xù)催化反應(yīng)10批次，酶活力仍保留86.3%。該固定化SAM合成酶具有酶活力回收率高、操作穩(wěn)定性好及便于儲存等優(yōu)點(diǎn)。

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