黑龍江遜克地區(qū)森林革蜱斑點(diǎn)熱立克次體DNA的檢測(cè)

馮 立,王 卓,楊 軍,于 淼,王立強(qiáng),邱廣斌,翟如波,吳益民

斑點(diǎn)熱(Spotted Fever, SF)是由斑點(diǎn)熱群立克次體(spotted fever group rickettsia, SFGR)引起，經(jīng)蜱(少數(shù)由螨或蚤)傳播的人獸共患自然疫源性疾病, 分布于世界各地。SFGR群內(nèi)種類(lèi)繁多，目前世界上巳發(fā)現(xiàn)近20種SFGR[1-2]。研究資料表明，由SFGR引起的斑點(diǎn)熱病在我國(guó)很多地區(qū)廣泛存在。我國(guó)巳分離到的SFGR有西伯利亞(Rickettsiasibirica)、黑龍江(Rickettsiaheilongjiangsis)立克次體，二者巳從蜱和病人分得[3-5]。

東北地區(qū)為我國(guó)最早發(fā)現(xiàn)的斑點(diǎn)熱自然疫源地。為了解SFGR在當(dāng)?shù)孛浇轵绲母腥炯癝FGR種型，我們應(yīng)用PCR方法對(duì)黑龍江遜克地區(qū)森林革蜱作了SFGR DNA檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1蜱標(biāo)本采集 選擇中俄邊界黑龍江遜克地區(qū)不同生境采用人工布旗法采集蜱類(lèi)，浸漬于70%酒精溶液中, 分類(lèi)鑒定后進(jìn)行DNA提取。

1.2蜱標(biāo)本DNA提取 取出浸漬于70% 酒精溶液的森林革蜱用生理鹽水洗滌3次, 濾紙吸干，于EP管內(nèi)40 ℃過(guò)夜烘干。每只1組用玻璃研磨器研碎，應(yīng)用上海生工生物公司“一管式基因組DNA抽提試劑盒”按說(shuō)明書(shū)操作提取DNA, DNA模板置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR檢測(cè) 采用SFGR外膜蛋白A基因(ompA)和立克次體檸檬酸合成酶基因(gltA)按文獻(xiàn)[1.6]設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物公司合成。引物序列和擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。

表1 PCR 擴(kuò)增的目的基因及其引物序列

1.4核酸序列測(cè)定及聚類(lèi)分析 PCR 陽(yáng)性產(chǎn)物送上海申工生物技術(shù)公司測(cè)序。應(yīng)用Internet網(wǎng)中BLAST操作平臺(tái)，將測(cè)序所得結(jié)果與GenBank中注冊(cè)的國(guó)際上常見(jiàn)的SFGR相應(yīng)基因進(jìn)行比較，采用DNAstar及Mega 5.0軟件進(jìn)行序列分析和聚類(lèi)分析。

2 結(jié) 果

2.1SFGR 檢測(cè)結(jié)果 對(duì)調(diào)查地區(qū)采集的森林革蜱(Dermacentorsilvarum)60只(雄、雌各30只)，用SFGRompA引物70p/701n進(jìn)行PCR檢測(cè)。檢出陽(yáng)性14份, 陽(yáng)性率為23.33%，其中雄性和雌性蜱標(biāo)本檢出陽(yáng)性率分別為13.33%和10.00%。PCR電泳結(jié)果見(jiàn)圖1.2。對(duì)ompA陽(yáng)性蜱標(biāo)本同時(shí)用gltA引物Rpcs877p/Rp1258n進(jìn)行PCR擴(kuò)增。隨機(jī)選擇2份ompA和gltA擴(kuò)增陽(yáng)性標(biāo)本(XK-36, XK-40)作DNA測(cè)序。

2.2核苷酸序列比較 陽(yáng)性標(biāo)本XK-36和XK-40的ompA和gltA測(cè)序所得基因片段序列對(duì)比，二者的相似性均為100%。將XK-36ompA和gltA片段序列分別進(jìn)行同源性比較和聚類(lèi)分析。

XK-36ompA基因片段序列去掉兩端引物，將其589 bp片段和GenBank中注冊(cè)的主要SFGR的相應(yīng)基因進(jìn)行同源性比較，結(jié)果與Rikettsiasp.JL-02株關(guān)系最近，同源性達(dá)99.30%，兩者僅有3個(gè)堿基差異；與Rikettsiaraoultii的同源性為99.18%，與Rikettsiaheilongjiangsis和Rikettsiajaponica的同源性分別為92.90%和92.50%。

XK-36gltA基因片段序列去掉兩端引物，將其331 bp片段和主要SFGR的相應(yīng)基因進(jìn)行同源性比較，結(jié)果與Rikettsiaraoultii和Rikettsiasibirica同源性均為98.50%；與Rikettsiaheilongjiangsis和Rikettsiajaponica同源性均為98.20%。

圖1ompA基因的PCR擴(kuò)增

Fig.1PCRamplifiedompAgenesintheticks

M: DNA maker (DL2000); 1: Positive control;

2: Negative control; 3, 4, 6: PCR positive;

5: PCR negative.

圖2gltA基因的PCR擴(kuò)增

Fig.2PCRamplifiedgltAgenesintheticks

M: DNA maker (DL2000); 1: Positive control;

2: Negative control; 4, 6: PCR positive;

3, 5: PCR negative.

2.3核苷酸序列聚類(lèi)分析 從圖3ompA基因聚類(lèi)分析可見(jiàn)，XK-36和Rikettsiasp.JL-02株分類(lèi)一致和Rikettsiaraoultii株、蒙大拿立克次體與馬賽立克次體同屬一支。從圖4gltA基因聚類(lèi)分析可見(jiàn)，XK-36和Rikettsiaraoultii和Rikettsiasibirica比較接近，然并非同一支。

圖3XK-36與SFGRompA核苷酸序列聚類(lèi)分析

Fig.3PhylogeneticanalysisofnucleotidesequencesofexanimatedXK-36ompAgene

圖4XK-36與SFGRgltA核苷酸序列聚類(lèi)分析

Fig.4PhylogeneticanalysisofnucleotidesequencesofexanimatedXK-36gltAgene

3 討 論

東北地區(qū)生態(tài)環(huán)境和氣溫條件適宜節(jié)肢動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物生長(zhǎng), 是我國(guó)最早發(fā)現(xiàn)的SFGR自然疫源地。該地區(qū)蜱類(lèi)豐富，優(yōu)勢(shì)蜱種為森林革蜱、嗜群血蜱、日本血蜱、全溝硬蜱及長(zhǎng)角血蜱，已從前三者分離到2種SFGR—R.sibirica和R.heilongjiangsis[3-5]。

本次調(diào)查證明，黑龍江遜克地區(qū)森林革蜱 SFGR 檢出陽(yáng)性率為23.33%，具有較高的帶毒率, 雄性和雌性蜱檢出陽(yáng)性率無(wú)差異，說(shuō)明該地區(qū)存在蜱傳斑點(diǎn)疫源地。同源性比較與聚類(lèi)分析結(jié)果表明, XK-36ompA基因序列與Rikettsiasp.JL-02同源性達(dá)99.30%，而與我國(guó)分離的R.heilongjiangsis、R.sibirica和R.mongolotimonae差異較大。gltA同源性分析顯示, XK-36和R.raoultii和R.sibirica比較接近。

Rikettsia. sp. JL-02系從吉林長(zhǎng)白山森林革蜱檢測(cè)出(2003)，它和前蘇聯(lián)西伯利亞地區(qū)草原革蜱(D.nutallii)檢出的新基因型Rikettsiasp.DnS14的ompA基因序列完全一致[7-9]。由于Rikettsiasp.DnS14首次檢出于西伯利亞地區(qū)草原革蜱(1999)，Rikettsiasp.JL-02和XK-36分別從我國(guó)吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)和黑龍江流域遜克地區(qū)森林革蜱檢測(cè)到，三者同屬于東北亞地區(qū)，有著相似的地理環(huán)境和蜱種群分布，推測(cè)XK-36與Rikettsiasp.JL-02和Rikettsiasp.DnS14屬于同一基因型。Roux[10]基于rrs基因序列比較,把Rikettsiasp.JL-02與R.heilongjiangsis和R.japonica歸屬于同一簇。以序列比較建立的聚類(lèi)分析是來(lái)自某一基因片段，有時(shí)部分基因序列是無(wú)法代表整個(gè)基因序列。Fournier等人[11]提出了基于基因序列比較的立克次體新種定義標(biāo)準(zhǔn)，采用多個(gè)基因綜合比較分析的方法。因此獲得病原體，將有利于從病原學(xué)、流行病學(xué)及分子生物學(xué)作進(jìn)一步研究。

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，促進(jìn)了蜱媒傳染病的自然疫源地調(diào)查研究水平, 通過(guò)以蜱為目標(biāo), 探索和發(fā)現(xiàn)已知或未知的病原體，及病原體、蜱與疾病的關(guān)糸。本次調(diào)查以PCR檢測(cè)與序列分析，表明黑龍江流域遜克地區(qū)森林革蜱攜帶與Rikettsiasp.JL-02基因型一致的SFGR, 該地區(qū)存在斑點(diǎn)熱疫源地。擴(kuò)大調(diào)查范圍，增加檢測(cè)蜱樣本數(shù)量、蜱種與測(cè)序樣本數(shù)量，可為斑點(diǎn)熱疫源地的證實(shí)提供更可靠依據(jù)。

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