廣州管圓線蟲在長爪沙鼠體內的發(fā)育及其引起的病理損害

韋永芳，陳代雄，梁成結，羅曉東，朱郇憫

廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)是引起嗜酸粒細胞增多性腦膜炎和腦膜腦炎的重要病原體。人多因食生或半生含有廣州管圓線蟲Ⅲ期幼蟲的中間宿主(如褐云瑪瑙螺等)而感染。由該蟲引起的廣州管圓線蟲病已在多個國家先后暴發(fā)[1-4]。國內外學者認為長爪沙鼠(Mongolian gerbil，Meriones unguiculatus)對多種原蟲、線蟲、絳蟲和吸蟲等實驗性感染易感，現(xiàn)已成功建立了包括馬來絲蟲、藍氏賈弟鞭毛蟲、微小膜殼絳蟲、類圓線蟲等多種寄生蟲的長爪沙鼠感染動物模型[5-9]，本研究以廣州管圓線蟲第Ⅲ期幼蟲感染長爪沙鼠，以探討廣州管圓線蟲對長爪沙鼠的致病性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1褐云瑪瑙螺(Achatinafulica) 采集自廣州市番禺區(qū)。

1.1.2長爪沙鼠 體重45～60 g之間，雌雄各半，由廣州醫(yī)學院實驗動物中心提供[SYXK(粵)2010-0104]。

1.2方法

1.2.1廣州管圓線蟲第3期幼蟲 參照李華等[10]報道的方法從褐云瑪瑙螺中分離。將褐云瑪瑙螺去殼，稱重后剁碎，每1 g螺肉加入20 mL人工消化液(配置方法:每1 000 mL消化液含3 g胃蛋白酶、7 mL濃鹽酸、993 mL水)，37 ℃恒溫箱中消化2 h后經篩網(wǎng)過濾，濾液靜置30 min后，置于方皿中，解剖鏡下檢查廣州管圓線蟲第Ⅲ期幼蟲(L3)。

1.2.2動物感染 參照陳代雄等[11]方法進行。長爪沙鼠稱重后，隨機分為對照組20只，腹腔注射生理鹽水；感染組50只，腹腔注射廣州管圓線蟲第3期幼蟲，10條/鼠。

1.3觀察指標

1.3.1動物一般行為觀察 觀察感染后長爪沙鼠的生理學變化，記錄長爪沙鼠的死亡情況。

1.3.2檢獲蟲體數(shù)和蟲體的組織分布 分別在感染后不同時間(第7、21、28、35、46 d)剖殺部分感染的長爪沙鼠和檢查實驗過程中瀕死或死亡的感染沙鼠，分離腦和心肺組織，先用肉眼及解剖鏡觀察，如有幼蟲則檢獲，余下組織經充分撕碎后加人工消化液置于37 ℃水浴箱消化2 h，再行過濾、沉淀，解剖顯微鏡下檢獲蟲體。記錄各組織中檢獲的雌雄蟲體數(shù)量，并觀察蟲體形態(tài)結構。

1.3.3組織病變觀察 分離感染后不同時間的腦和肺組織，肉眼觀察其病變特點；福爾馬林固定后，進行石蠟包埋、切片和HE染色。

2 結 果

2．1動物一般行為變化 長爪沙鼠在感染后第8 d即有不同程度食欲減退、萎靡、活動減少等；約第16 d部分沙鼠出現(xiàn)被毛散亂、閉眼、脊柱側彎等癥狀；感染后第17～18 d，部分長爪沙鼠出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，打轉和癱瘓等神經系統(tǒng)癥狀，隨著時間推移，出現(xiàn)這些癥狀的長爪沙鼠數(shù)量增加，癥狀也逐漸加重，出現(xiàn)不同程度進食和飲水困難。感染后第23 d開始出現(xiàn)死亡，23～30 d為死亡的高峰時間，瀕死或死亡的沙鼠共28只；除了剖殺和死亡外，最終有12只能生存至感染后第46 d。

2．2檢獲蟲體數(shù) 對照組長爪沙鼠腦組織均未檢獲到廣州管圓線蟲。感染后第7 d未能從腦組織中檢獲蟲體；感染后第23～46 d檢查鼠35只(包括活的、頻死的和死的)，共檢獲蟲體127條(♀62/♂65)，蟲體收獲率約為36.29%(127/350)，平均蟲數(shù)為(3.63±1.46)/鼠。感染后第21 d長爪沙鼠腦組織中即檢獲出第Ⅴ期幼蟲，感染后腦中的蟲體數(shù)量隨時間呈現(xiàn)出不規(guī)則上升，23～30 d達峰值后逐漸下降；而第27～30 d后，心肺組織中呈現(xiàn)出不規(guī)則上升，檢獲的蟲體大部分已發(fā)育成Ⅴ期幼蟲或成蟲，至41 d后發(fā)育為性成熟的成蟲，感染后第46 d從存活的12只沙鼠的肺動脈中均檢獲到雌雄蟲寄生和單性寄生蟲體，6只為雌雄蟲寄生，其中4只糞便中查到廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲((圖1 A1-A2)；6只為單性蟲體寄生，糞便中均未查到Ⅰ期幼蟲。長爪沙鼠感染廣州管圓線蟲L3不同時間后，其腦和心肺內蟲體的分布見表1。

表1 感染后不同時間長爪沙鼠的腦和心肺組織檢獲的蟲體數(shù)

Note: * Brain and lung of other 10 infected gerbils were used for pathological examination.

2.3病理變化

2.3.1肉眼觀察 長爪沙鼠感染廣州管圓線蟲后第7 d腦組織病理變化不明顯。感染后第23 d，長爪沙鼠以腦部病變?yōu)橹?，可見腦組織表面有不同程度的血管擴張與充血、出血及粘連；而肺部呈彌漫性充血改變。感染后第38～46 d，以肺部病變?yōu)橹鳎谓M織表現(xiàn)為不同程度局灶性充血腫脹，表面及切面質硬粗糙呈灰白色顆粒狀，還可見到點狀小片狀出血灶；腦組織病變較輕，只有局限性血管擴張和充血(圖2 A1-B3)。

2.3.2病理切片觀察 感染后第25 d蛛網(wǎng)膜下腔可見蟲體，蟲體周圍有出血。第38 d，蛛網(wǎng)膜下腔仍可見蟲體，肺內可見多個橢圓形蟲卵；第45 d，肺內可見多個橢圓形蟲卵，蟲卵為多細胞期或幼蟲期，部分肺泡輪廓消失和大量炎癥細胞浸潤。

圖1檢獲的廣州管圓線蟲

Fig.1WormrecoveryofA.cantonensis

A: Adult worm; B:A.cantonensis1st-stage larvae in stools (10×10)

圖2 長爪沙鼠感染廣州管圓線蟲后腦和心肺組織的變化

3 討 論

大鼠和小鼠是目前多數(shù)使用的廣州管圓線蟲感染動物模型，大鼠是廣州管圓線蟲的適宜終宿主，而小鼠、豚鼠、兔、恒河猴和人類是其非適宜宿主，廣州管圓線蟲可通過適宜宿主大鼠的中樞神經系統(tǒng)(CNS)移行到肺動脈，并在心肺發(fā)育成熟；非適宜宿主，大多數(shù)L3幼蟲移行到腦，經歷兩次蛻皮，未成熟的成蟲移行到蛛網(wǎng)膜下腔，但在心肺未能發(fā)育為性成熟[12-15]。以往的研究證實長爪沙鼠是一種對多種寄生蟲易感的實驗動物，是馬來絲蟲、微小膜殼絳蟲(肥頭絳蟲和多房棘球絳蟲)的終宿主，幼蟲可在沙鼠中建立、生長、發(fā)育到妊娠的成年階段[5,7],此外也用于線蟲的感染，如棘唇線蟲、類圓線蟲、美洲板口線蟲等[8，17-19]。長爪沙鼠用于廣州管圓線蟲感染研究很少見于報道[20-21]。過往的研究中長爪沙鼠被認為是廣州管圓線蟲適宜宿主但不大易感，我們的研究結果顯示廣州管圓線蟲在感染沙鼠后約3周開始從腦移行至肺，在肺中發(fā)育至成蟲并產卵，與大鼠的情況相似[22]，符合適宜宿主特點。然而感染后第46 d，仍有部分蟲體滯留于腦，且到達肺的蟲體仍有個別未完全發(fā)育成熟；此外，與大鼠比較[12-15]，長爪沙鼠對廣州管圓線蟲感染耐受性明顯較差，曾腹腔注射35條幼蟲/鼠、15條幼蟲/鼠廣州管圓線蟲第3期幼蟲，第32 d 80%以上的沙鼠死亡，即使感染蟲數(shù)減為10條幼蟲/鼠，感染后第30 d 62%的沙鼠死亡。

長爪沙鼠通常在感染2周后出現(xiàn)明顯的神經系統(tǒng)癥狀，如步態(tài)不穩(wěn)，打轉和癱瘓等，感染3周后出現(xiàn)死亡；在感染后第23～46 d，腦內蟲體數(shù)量逐漸減少，肺內蟲體數(shù)量逐漸增加(表2)，提示蟲體由腦向肺移行。肉眼和病理檢查結果提示長爪沙鼠感染后30 d 內以腦損害為主，表現(xiàn)為腦膜充血、出血及粘連等特點的嗜酸性粒細胞增多性腦膜炎。30 d后以肺部損害為主，成蟲可在肺部產卵形成蟲卵結節(jié)，表現(xiàn)肉芽腫性肺炎[23]，這與大鼠的病理損傷一致[24]。實驗中發(fā)現(xiàn)感染后腦組織中未查出蟲體的長爪沙鼠的腦組織變化程度明顯輕微，出現(xiàn)癥狀的時間也推后，推測這與蟲數(shù)多寡在腦組織中的移行造成腦組織的機械損傷,以及蟲體的代謝、分泌產生的毒性產物導致了腦組織非特異性炎性病變反應有關。

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