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    生物芯片微陣列圖像傾斜校正算法研究

    2014-04-01 01:01:34吳灶全陳熹婁艷陽陳杰劉正春
    關(guān)鍵詞:生物芯片樣點(diǎn)圓形

    吳灶全,陳熹,婁艷陽,陳杰,劉正春

    (中南大學(xué) 地球科學(xué)與信息物理學(xué)院,生物醫(yī)學(xué)工程研究所,湖南 長沙,410083)

    生物芯片是通過平面微細(xì)加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng),以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測,具有多通道、高通量、并行自動(dòng)處理等優(yōu)點(diǎn)。通過處理和分析生物芯片數(shù)字熒光圖像,識(shí)別并提取陣列中每個(gè)樣點(diǎn)區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度,進(jìn)行定量分析和相關(guān)信息挖掘[1-3]。樣點(diǎn)的識(shí)別和分割是微陣列分析的核心,但是由于誤差和外界干擾,在制備和掃描過程中芯片和圖像經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一定程度的傾斜和旋轉(zhuǎn),甚至樣點(diǎn)分布歪曲。這樣,芯片圖像中樣點(diǎn)陣列的準(zhǔn)直特性必定受到影響,網(wǎng)格定位結(jié)果將會(huì)出現(xiàn)較大誤差,最終導(dǎo)致樣點(diǎn)的識(shí)別與分割不準(zhǔn)確,也得不到滿意的分析效果。常見的傾斜校正方法有霍夫(Hough)變換,傅里葉(Fourier)變換,拉東(Radon)變換,投影特性法和最小二乘法等[4-8],根據(jù)它們改進(jìn)的算法一直都是研究的重點(diǎn)。Meyenhofer 等[9]通過計(jì)算投影波形的方差尋找校正角度,并進(jìn)行多次投影計(jì)算獲得最大投影方差值,對(duì)應(yīng)的角度即為圖像傾斜角度。該方法在尋優(yōu)的過程中需要多次對(duì)芯片圖像進(jìn)行投影計(jì)算以及方差計(jì)算,在同樣精度下計(jì)算效率顯得相當(dāng)?shù)汀eng 等[10]通過計(jì)算投影波形的能量譜密度獲得旋轉(zhuǎn)角度,并進(jìn)行多次旋轉(zhuǎn)搜索獲得最大能量譜密度,對(duì)應(yīng)的角度即為最佳校正角度。該方法盡管減少了校正角度的搜索次數(shù),但是每次搜索都需要通過傅里葉變換計(jì)算能量譜密度,龐大的計(jì)算量約束了傾角檢測的速度。劉艷等[11]運(yùn)用Sobel 算子對(duì)芯片圖像進(jìn)行邊界提取,然后通過Radon 變換確定傾斜角度。雖然邊界提取能減少Radon 變換的計(jì)算量,但是在檢測矩形樣點(diǎn)圖像的傾角時(shí)運(yùn)算效率不高。嚴(yán)偉等[12]提出了Radon 變換和功率譜估計(jì)相結(jié)合的功率切片方法,并以此建立起三維功率譜密度圖,實(shí)現(xiàn)傾斜角度的精確計(jì)算。該方法采取了Radon 投影和功率譜的級(jí)聯(lián)運(yùn)算,但檢測精度僅為1.0°,且計(jì)算量也相當(dāng)龐大。這些常見的傾斜校正算法一般都使用單一的方法處理各種形狀樣點(diǎn)的微陣列圖像,造成對(duì)某些形狀樣點(diǎn)圖像的傾斜校正效果不佳[13-14]。通過比較分析發(fā)現(xiàn)矩形樣點(diǎn)和圓形樣點(diǎn)在形狀和幾何空間規(guī)律上有明顯的差別,綜合考慮校正精度和運(yùn)算速度等因素,本文作者提出了對(duì)矩形和圓形樣點(diǎn)的芯片圖像分別采用改進(jìn)的Hough變換和改進(jìn)的Radon 變換進(jìn)行傾角檢測。

    1 傾斜校正算法

    1.1 改進(jìn)的Hough 變換

    Hough 變換將xy 平面直線檢測問題轉(zhuǎn)化為ρθ 參數(shù)空間尋找局部最大值的問題,能有效地檢測直線傾斜角度,并廣泛應(yīng)用于檢測感興趣的區(qū)域邊緣。Hough變換的優(yōu)點(diǎn)在于抗噪聲的能力強(qiáng),并不受圖像中直線走勢的影響。但Hough 變換的精確度和運(yùn)算復(fù)雜度存在著矛盾,而且對(duì)存儲(chǔ)空間的要求比較大[15-16]。ρθ 參數(shù)空間量化得越精細(xì),算法的精度越高,算法所需的存儲(chǔ)空間和運(yùn)算量也越大。雖然生物芯片的傾斜角度不大,大量統(tǒng)計(jì)得到傾斜角度范圍是[-5°,5°],但是要求的精度比一般的直線檢測要高[17],為了適應(yīng)生物芯片技術(shù)的發(fā)展,傾角的檢測精度如能從0.1°提升到0.01°,有利于提高分析結(jié)果的精確度。本文結(jié)合了矩形樣點(diǎn)的形狀和分布特點(diǎn)對(duì)Hough 變換進(jìn)行改進(jìn),從而提高樣點(diǎn)邊緣檢測精度,減少ρθ 參數(shù)空間的計(jì)算量,提升其實(shí)用價(jià)值。

    在對(duì)Hough 變換進(jìn)行改進(jìn)的過程中,參考了傾斜文檔掃描圖像的校正方法[18-19]。傾斜文檔圖像的校正方法中經(jīng)常將文字簡化成類似矩形的連通體,并通過提取水平邊緣來減少計(jì)算量。針對(duì)矩形樣點(diǎn)的形狀特征和分布規(guī)律,本算法對(duì)Hough 變換進(jìn)行了改進(jìn)。對(duì)生物芯片圖像進(jìn)行二值化后,僅計(jì)算矩形樣點(diǎn)的上下邊緣像素的Hough 參數(shù)和累計(jì)值。根據(jù)所得的Hough參數(shù)空間,提取占主導(dǎo)的直線組,并計(jì)算出直線組平均傾斜角度,從而得到最佳校正角度。

    1.1.1 對(duì)生物芯片圖像進(jìn)行二值化

    本算法將采用大津算法(Otsu 算法)法對(duì)生物芯片圖像進(jìn)行二值化,它在確保運(yùn)算速度與準(zhǔn)確度的同時(shí),能將樣點(diǎn)與背景很好地分割開來[20-21]。Otsu 算法,又稱最大類間方差法,是一種自動(dòng)的非參數(shù)非監(jiān)督的閾值選擇法,具有優(yōu)良的性能,其效果一直是分割算法中的參考標(biāo)準(zhǔn)[22-23]。當(dāng)部分背景被錯(cuò)分為對(duì)象時(shí),會(huì)導(dǎo)致兩類之間的差別變小。而Otsu 法的原理正是選擇閾值使得背景與對(duì)象兩類之間的方差最大化,即兩部分之間的差別最大,意味著錯(cuò)分的概率最小,類間分割效果最好。

    在檢測傾斜角度之前,先對(duì)生物芯片圖像進(jìn)行灰度化,然后進(jìn)行一次形態(tài)學(xué)的開閉運(yùn)算級(jí)聯(lián)操作[24]。由于開操作能抑制較小的亮噪聲,閉操作能抑制背景的暗噪聲,因此開閉操作消除了圖像中的孤立亮點(diǎn),平滑背景并保留了樣點(diǎn)主體區(qū)域。開閉操作會(huì)產(chǎn)生一定的模糊,為保證盡量小地改變樣點(diǎn)形狀,應(yīng)該選擇較小的結(jié)構(gòu)元。接著選擇Otsu 算法自動(dòng)計(jì)算最佳分割閾值,并使用這閾值將芯片圖像二值化。所得二值圖像的白色區(qū)域(灰度為255)代表芯片樣點(diǎn),黑色區(qū)域(灰度為0)代表芯片背景,這樣就消除了原圖像背景中噪聲的干擾,也減少一定的計(jì)算量。

    1.1.2 計(jì)算Hough 參數(shù)空間

    在運(yùn)用Hough 變換進(jìn)行傾斜檢測時(shí),若對(duì)圖像中每一個(gè)像素點(diǎn)都進(jìn)行Hough 變換,那么計(jì)算量相當(dāng)大,將會(huì)影響算法運(yùn)算速度,降低其實(shí)用價(jià)值。本算法提出在進(jìn)行Hough 變換之前先對(duì)像素點(diǎn)進(jìn)行判別,若當(dāng)前像素點(diǎn)符合條件,則進(jìn)行Hough 變換,否則跳轉(zhuǎn)到下一個(gè)像素點(diǎn)。這不僅可以減少部分矩形樣點(diǎn)的不平整邊緣的影響,還大大提高了運(yùn)算速度和準(zhǔn)確度。

    像素點(diǎn)的灰度判別準(zhǔn)則:若當(dāng)前像素灰度為0,且下一行同樣位置的像素灰度為255;或者若當(dāng)前像素灰度為255,且下一行同樣位置的像素灰度為0,則計(jì)算當(dāng)前像素點(diǎn)的Hough 參數(shù)(ρ,θ),即僅統(tǒng)計(jì)矩形樣點(diǎn)的上下邊緣像素。因此,這改進(jìn)的Hough 算法僅適合矩形樣點(diǎn),不適合圓形樣點(diǎn)。按照上述的判別準(zhǔn)則,以二值圖像的中心為計(jì)算原點(diǎn),以對(duì)角線長度為ρ 軸最大值,步長為1;以5°為θ 軸的最大值,步長為0.01°,計(jì)算Hough 參數(shù)空間。統(tǒng)計(jì)(ρ,θ)參數(shù)空間中各正弦曲線角度的信號(hào)累加值,對(duì)應(yīng)著各個(gè)角度上特征點(diǎn)的累計(jì)數(shù)量。

    1.1.3 提取占主導(dǎo)的直線組

    無論是準(zhǔn)則圖像還是傾斜圖像,同一行矩形樣點(diǎn)的上(下)邊緣都處在同一條直線上,故可以通過累計(jì)同一行樣點(diǎn)的上(下)邊緣長度,來判別該行樣點(diǎn)是否對(duì)圖像傾斜貢獻(xiàn)較大。顯然,占主導(dǎo)地位的都是累計(jì)長度較長的直線,對(duì)應(yīng)的矩形樣點(diǎn)行信號(hào)強(qiáng)度好、樣點(diǎn)數(shù)量多。

    在提取占主導(dǎo)地位的樣點(diǎn)上(下)邊緣之前,選擇圖像寬度的1/10 為最小直線長度Amin。遍歷Hough 參數(shù)空間,若參數(shù)空間坐標(biāo)(ρi,θj)的累加值為A(i,j),代表直線xcos θj+ysin θj=ρi的累計(jì)長度為A(i,j)。若線長度A(i,j)小于Amin,則表明該直線不占主導(dǎo)地位,應(yīng)舍去不記錄。反之,若線長度A(i,j)不少于Amin,則要進(jìn)一步判別它是否局部極大值。根據(jù)檢測精度確定合理的局部峰值半徑r,將Hough 參數(shù)空間中A(i,j)的r×r 鄰域值與當(dāng)前累加值A(chǔ)(i,j)比較,若A(i,j)在局部區(qū)域內(nèi)仍是極大值,則表明該直線起主導(dǎo)作用,應(yīng)保存并用于下一步計(jì)算。

    1.1.4 計(jì)算直線組的平均傾斜角度

    其中:Rm為直線的相對(duì)長度;θm為直線的傾斜角度;相對(duì)長度不少于0.5 的直線有M 條。

    1.2 改進(jìn)的Radon 變換

    雖然Hough 直線檢測能很好地應(yīng)用在矩形樣點(diǎn)圖像上,但是Hough 圓形檢測在圓形樣點(diǎn)圖像的傾斜檢測上不具優(yōu)勢。圖像中的圓形樣點(diǎn)很少是標(biāo)準(zhǔn)的圓形,樣點(diǎn)邊緣經(jīng)常有缺口或樣點(diǎn)內(nèi)部存在空洞,容易引起Hough 圓形檢測的漏檢[25]。其次,在存儲(chǔ)空間方面,由于Hough 圓形檢測存在3 個(gè)參數(shù),導(dǎo)致建立累加器所需要空間是Hough 直線檢測的平方級(jí)[26]。因此,圓形樣點(diǎn)的芯片圖像不適宜使用Hough 變換來檢測傾角??紤]到檢測精度和運(yùn)算存儲(chǔ)空間的關(guān)系,本算法選擇選用了Radon 變換[27-28]。

    針對(duì)圓形樣點(diǎn)的形狀特征和分布規(guī)律,對(duì)Radon變換進(jìn)行了改進(jìn)。在提取生物芯片圖像中圓形樣點(diǎn)的邊緣后,對(duì)邊緣圖像進(jìn)行二級(jí)Radon 變換,通過搜索得到最佳校正角度。它能精確地檢測出規(guī)則或不規(guī)則的圓形樣點(diǎn)圖像的傾斜角度[29],同時(shí)減少了Radon 參數(shù)空間的存儲(chǔ)量,并提高了運(yùn)算速度。

    1.2.1 提取樣點(diǎn)邊緣

    在檢測傾斜角度之前,先對(duì)生物芯片圖像進(jìn)行灰度化,然后進(jìn)行一次形態(tài)學(xué)的開閉運(yùn)算級(jí)聯(lián)操作。接著選擇Otsu 算法自動(dòng)計(jì)算最佳分割閾值,并使用這閾值將芯片圖像二值化。灰度化與二值化的方法跟Hough 變換中所用方法是一樣的。

    由于Radon 變換的計(jì)算量較大[30-31],為了減少檢測的計(jì)算量,在進(jìn)行Radon 變換之前,先提取圓形樣點(diǎn)的邊緣。使用最小的結(jié)構(gòu)元B 對(duì)原二值圖像A 進(jìn)行腐蝕,再用原二值圖像A 減去腐蝕圖像εB(A),即可得到邊緣圖像β(A)=A-εB(A),且其邊緣寬度為1。對(duì)比提取邊緣前后的Radon 參數(shù)空間可知:提取邊緣后得到的正弦圖的整體亮度減弱,即正弦曲線的數(shù)量減少,但具體位置未變,故仍能很好地代表樣點(diǎn)投影信號(hào)。通過精簡正弦圖來減少計(jì)算量,保持了準(zhǔn)確度而又不影響檢測效果,這就是Radon 變換的初步改進(jìn)。

    1.2.2 二級(jí)Radon 變換

    Radon 變換一般將圖像的中心位置作為投影原點(diǎn),采用其離散形式[32-33],投影信號(hào)表達(dá)式為:

    其中:(x,y)為二值邊緣圖像中的坐標(biāo);(ρ,θ)為Radon參數(shù)空間中的坐標(biāo), x,y,ρ,θ 均為離散變量。固定θ 為θk,通過覆蓋圖像所要求的ρ 的所有值產(chǎn)生一個(gè)投影g(ρ,θk)。改變?chǔ)?并重復(fù)上述過程,則產(chǎn)生另外的投影。最終得到以ρ,θ 為變量的二維數(shù)組g(ρ,θ),并可以利用這數(shù)組合成正弦圖,而正弦圖中像素的亮點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的g 成正比。

    針對(duì)圓形樣點(diǎn)邊緣進(jìn)行的Radon 變換,如果檢測精度較高時(shí),計(jì)算量的數(shù)量級(jí)也相應(yīng)增加。為了減少搜索次數(shù),本算法采用二級(jí)不同尺度的搜索策略[34],先進(jìn)行粗略搜索,在確定大致范圍后再進(jìn)行精細(xì)搜索。

    不同尺度的搜索策略在很多傾斜校正的算法中都有體驗(yàn),其減少存儲(chǔ)空間、提高運(yùn)算速度的作用是顯而易見的。大量實(shí)驗(yàn)證明,采用二級(jí)Radon 變換算法后計(jì)算量明顯減少,要比同樣精度的直接Radon 變換的計(jì)算量少一半以上。

    2 實(shí)驗(yàn)與討論

    2.1 針對(duì)矩形樣點(diǎn)改進(jìn)的Hough 變換的效果

    圖1 改進(jìn)的Hough 變換的效果圖Fig.1 Effect of improved Hough transform

    實(shí)驗(yàn)表明改進(jìn)的Hough 變換在檢測精度、存儲(chǔ)空間和運(yùn)算速度方面有良好的表現(xiàn),非常適合用于矩形樣點(diǎn)圖像的傾角檢測。對(duì)于長×寬為2 668×1 813 的矩形樣點(diǎn)芯片圖像,運(yùn)用本文改進(jìn)的Hough 變換和同類的算法進(jìn)行傾角檢測,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1 所示。改進(jìn)的Hough 變換僅需耗時(shí)4.730 s,得到的檢測結(jié)果2.19°與實(shí)際傾角2.15°相差僅為0.04°,算法誤差范圍為±0.05°,效率和準(zhǔn)確度比同類的算法更優(yōu)越。而對(duì)于沒有經(jīng)過改進(jìn)的Hough 變換,檢測耗時(shí)為15.019 s,檢測結(jié)果為2.1°,檢測誤差范圍為±0.1°。對(duì)比前后2種Hough 變換的檢測速度和誤差范圍可見:本文對(duì)Hough 變換的改進(jìn)和優(yōu)化的效果明顯,僅統(tǒng)計(jì)矩形樣點(diǎn)的上下邊緣像素的Hough 參數(shù)和累計(jì)值,不但大大減少Hough 變換運(yùn)算的次數(shù),而且有效地減少誤差范圍;提取占主導(dǎo)地位的直線組,能避免對(duì)局部極大值點(diǎn)的誤判,且有效地減少背景噪聲對(duì)檢測的干擾。

    2.2 針對(duì)圓形樣點(diǎn)改進(jìn)的Radon 變換的效果

    為了驗(yàn)證改進(jìn)的Radon 變換的檢測精度和速度,現(xiàn)已知一幅長×寬為2 713×1 820 的圓形樣點(diǎn)芯片圖像的傾斜角度為1.55° (以逆時(shí)針為旋轉(zhuǎn)正方向),其局部截圖如圖2(a)所示,運(yùn)用改進(jìn)的Radon 變換進(jìn)行傾角檢測。對(duì)原芯片圖像進(jìn)行邊緣提取,其局部截圖如圖2(b)所示。提取到的圓形樣點(diǎn)的邊緣清晰可見,大部分樣點(diǎn)的形狀飽滿,行列間隙中基本不存在噪聲,非常適合Radon 投影。對(duì)二值邊緣圖像進(jìn)行第一級(jí)Radon 變換,在[-5°,5°]區(qū)間內(nèi)θ 以0.1°為步長,進(jìn)行第一級(jí)Radon 變換得到初級(jí)傾斜角度θm=1.6°,對(duì)應(yīng)的Radon 參數(shù)空間的截圖如圖2(d)所示。然后在[1.50°,1.70°]區(qū)間內(nèi)θ 以0.01°為步長,進(jìn)行第二級(jí)Radon 變換得到精確度更高的二級(jí)傾斜角度θm=1.58°,對(duì)應(yīng)的Radon 參數(shù)空間的截圖如圖2(e)所示。即得最佳的傾斜校正角度為-1.58°,對(duì)傾斜圖像進(jìn)行旋轉(zhuǎn)校正,運(yùn)用雙線性內(nèi)插方法對(duì)旋轉(zhuǎn)后的圖像進(jìn)行反向映射,得到校正后的圖像如圖2(c)所示。

    表1 對(duì)矩形樣點(diǎn)芯片圖像進(jìn)行傾角檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of inclination detection of microarray image with rectangular spots

    圖2 改進(jìn)的Radon 變換的效果圖Fig.2 Effect of improved Radon transform

    實(shí)驗(yàn)表明改進(jìn)的Radon 變換在檢測精度、存儲(chǔ)空間和運(yùn)算速度方面有良好的表現(xiàn),非常適合用于圓形樣點(diǎn)圖像的傾角檢測。對(duì)于長×寬為2 713×1 820 的圓形樣點(diǎn)芯片圖像,運(yùn)用本文改進(jìn)的Hough 變換和同類的算法進(jìn)行傾角檢測,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2 所示。改進(jìn)的Radon 變換僅需耗時(shí)5.137 s,得到的檢測結(jié)果1.58°與實(shí)際傾角1.55°相差僅為0.03°,算法誤差范圍為±0.04°;與同類算法相比,它能在更短的時(shí)間內(nèi)得到更精確的結(jié)果。而對(duì)于沒有經(jīng)過改進(jìn)的Radon 變換,傾角檢測耗時(shí)為21.659 s,得到的檢測結(jié)果為1.6°,檢測誤差范圍為±0.1°。比較檢測的速度和誤差范圍可見,本文對(duì)Radon 變換的改進(jìn)和優(yōu)化的效果明顯,提取圓形樣點(diǎn)的邊緣能大大減少Radon 變換投影運(yùn)算的次數(shù),且有效地減少檢測誤差;從粗到細(xì)的二級(jí)Radon變換將Radon 參數(shù)空間所占的內(nèi)存大大減少,并將檢測精度提高到0.01°。

    表2 對(duì)圓形樣點(diǎn)芯片圖像進(jìn)行傾角檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of inclination detection of microarray image with circular spots

    3 結(jié)論

    (1) 針對(duì)矩形樣點(diǎn)和圓形樣點(diǎn)各自的形狀和空間分布特點(diǎn),使用不同的方法分別檢測矩形和圓形樣點(diǎn)的芯片圖像,提出對(duì)矩形樣點(diǎn)圖像采用改進(jìn)的Hough變換檢測傾角,而對(duì)于圓形樣點(diǎn)則采用改進(jìn)的Radon變換,從而實(shí)現(xiàn)生物芯片圖像傾角的精確、快速檢測。

    (2) 本算法將傾角檢測精度提高到0.01°,檢測誤差范圍控制在±0.05°,對(duì)傾斜生物芯片圖像的檢測和校正取得滿意的效果,成功地解決現(xiàn)有方法中傾角檢測精度和速度不佳的問題。

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