阿茨海默病患者和正常老年人顳葉腦皮質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

耿艷 張紅紅 胡亞卓 韓志濤 耿淼 蔚文峰 甄里 夏征 王魯寧 張成崗

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一種慢性退行性疾病，發(fā)病率高，尤其多發(fā)于老年人群，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的記憶和認(rèn)知障礙，其病理特征是細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積所致老年斑和細(xì)胞內(nèi)過(guò)度磷酸化的tau蛋白所致神經(jīng)原纖維纏結(jié)，其常見(jiàn)的沉積部位如海馬、額葉和顳葉[1-3]。隨著技術(shù)的發(fā)展，研究者們做了很多工作以期通過(guò)基因和蛋白標(biāo)志物來(lái)揭示AD分子或細(xì)胞水平的信息，為探討其病因和發(fā)病機(jī)制提供線索，從而便于AD的預(yù)測(cè)和臨床預(yù)防?；蚪M學(xué)因其遺傳易感性和不隨時(shí)間變化的特質(zhì)，具有一定優(yōu)勢(shì)，因此早期進(jìn)行了很多相關(guān)研究。但因未發(fā)現(xiàn)合適的特異性或靈敏性標(biāo)志物，其研究結(jié)果并不令人滿意。本研究采用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry, 2D LC-MS/MS)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法[4-6]，以尸檢的老年人腦顳葉組織為標(biāo)本，通過(guò)分析AD和正常老年人腦組織中的主要差異蛋白，旨在發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)志物，并試圖找到能闡明AD病理生理機(jī)制的研究方法。

1 對(duì)象和方法

1.1觀察對(duì)象12例尸檢的老年男性顳葉腦組織，年齡78～90歲，取自2005-12-2013-03解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所老年組織庫(kù)收集的組織標(biāo)本。其中正常老年組6例，平均年齡(81.83±3.06)歲，死亡至尸檢的平均間隔時(shí)間為17.0 h；AD組6例，平均年齡(84.67±3.44)歲，死亡至尸檢的平均間隔時(shí)間為19.3 h。兩組間年齡、尸檢間隔時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。12例老年人生前營(yíng)養(yǎng)狀況均正常。腦組織標(biāo)本取材后均立即放入-80℃低溫冰柜保存。

正常老年人組均排除有神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及可能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、腦血管疾病、嗜酒、藥物成癮和精神方面疾??；AD組的老年人均為臨床(由解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科資深專(zhuān)家通過(guò)臨床癥狀、體征、相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查確診)和病理(尸檢組織通過(guò)Aβ、Tau、Ubiquitin和Synuclin 的免疫組織化學(xué)染色，由解放軍總醫(yī)院病理科資深專(zhuān)家診斷)兩方面確診的癡呆個(gè)體；另外，查閱兩組老年人的病史，排除可能影響實(shí)驗(yàn)的其他因素。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器：包括高效液相色譜儀(RIGOL 3220，北京普源精電)、液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(Eksigent液相-AB SCIEX TripleTOF 5600質(zhì)譜儀)、iTRAQ試劑盒(iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit，Applied Biosystems)、丙酮、氨水(北京化工廠)、尿素(Urea，法瑪西亞USB)、二硫蘇糖醇 (DTT，法瑪西亞USB)。

1.2.2蛋白質(zhì)提?。悍謩e將兩個(gè)組的6份組織樣本80 μg混合，在液氮條件下研磨成粉末，以1∶5的比例加入裂解液〔8 mol/L Urea，0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DTT〕，超聲破碎(超聲破碎1 s，停1 s，超聲破碎1 min)。以40 000g、4℃離心30 min，取上清。以考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法定量后，每組樣本分別取 100 μg蛋白，以1∶3的體積比例加入已預(yù)冷的丙酮，-20℃放置2 h后，以20 000g、4℃離心5 min，棄上清，自然風(fēng)干。

1.2.3iTRAQ標(biāo)記：分別于正常腦組織樣本和AD患者腦組織樣本中加入裂解液(dissolution buffer)，溶解蛋白并經(jīng)Bradford法定量。分別向蛋白溶液中加入胰蛋白酶(trypsin)，分別取80 μg用iTRAQ試劑盒進(jìn)行酶切標(biāo)記。正常腦組織樣本用115標(biāo)記，AD患者腦組織樣本用117標(biāo)記，標(biāo)記后樣本合并。

1.2.4肽段分離及鑒定：(1)第一維高pH反向色譜分離：色譜柱：C18反相柱(Agela, C18 色譜柱，250 mm×4.6 mm i.d.，填料顆粒直徑5 μm)；流動(dòng)相A：2%(液體)ACN-98% H2O(氨水調(diào)pH 10.0)；流動(dòng)相B：98%(液體)ACN-2%(液體)H2O(氨水調(diào)pH 10.0)；溶劑梯度：5%～8%流動(dòng)相B，1 min；8%～32%流動(dòng)相B，24 min；32%～95%流動(dòng)相B，2 min；95%流動(dòng)相B，4 min；95%～5%流動(dòng)相B，1 min；柱溫：45℃；流速：0.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm。組分收集：每分鐘1管，在8～32 min時(shí)收集。有效梯度內(nèi)，共24組分。(2)LC-MS質(zhì)譜上樣：5600參數(shù)設(shè)置：抽取干的樣本，溶解于A液(1.9%ACN/98%H2O/0.1%FA)，12 000 r/min離心(離心半徑=3 cm)3 min，取上清采用Eksigent液相-AB SCIEX TripleTOFTM5600質(zhì)譜儀檢測(cè)；色譜條件：液相：Eksigent Nano LC 2D plus；富集柱：自制C18，5 μm，ID 100 μm，20 mm Length；分離柱：自制C18,3 μm，ID 75 μm，120 mm Length；流動(dòng)相A:1.9%ACN+98% H2O+0.1%FA；流動(dòng)相B：98%ACN+1.9% H2O+0.1%FA；流速：330×10-3μL/min；洗脫條件：5% B 0 min, 5%～12%B 0～5 min, 12%～22% B 5～21 min, 22%～32% B 21.0～31.5 min, 32%～90% B 31.5～36.0 min, 90%～5% B 36～40 min；質(zhì)譜條件：數(shù)據(jù)采集時(shí)間40 min，噴霧電壓2.3 kV；毛細(xì)管溫度23.92℃；碰撞能量45；采集相對(duì)分子質(zhì)量范圍350～1250。

1.3數(shù)據(jù)分析ProteinPilotTMSoftware Beta (版本：4.2)搜索引擎，數(shù)據(jù)庫(kù)為human庫(kù)；一級(jí)誤差為10 ppm，二級(jí)誤差為20 ppm；合并搜庫(kù)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)用PDST軟件分析。選擇差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的結(jié)果報(bào)告。

1.4生物信息學(xué)分析基于iTRAQ定量比值，對(duì)蛋白質(zhì)的定量信息取Log值后符合正態(tài)分布曲線，然后利用95%置信區(qū)間法則來(lái)計(jì)算蛋白差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，篩選出存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白質(zhì)，作為后續(xù)分析的備選。通過(guò)生物信息學(xué)分析工具DAVID[7]對(duì)鑒定蛋白進(jìn)行Gene Ontology (GO)功能注釋、功能富集分析及定位分析。GO功能注釋包括生物學(xué)過(guò)程、分子功能以及細(xì)胞組分3個(gè)方面內(nèi)容。GO功能富集分析是指利用功能注釋工具高通量地對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋?zhuān)玫綄?shí)驗(yàn)鑒定蛋白質(zhì)在各類(lèi)生物學(xué)過(guò)程或分子功能上的分布情況，并將該分布與總體蛋白質(zhì)的分布進(jìn)行比較，從而確認(rèn)實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白質(zhì)在哪幾類(lèi)生物學(xué)過(guò)程或分子功能上顯著富集(P<0.05)。通過(guò)KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)軟件對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行通路分析。

表 1 AD組與正常老年組腦組織表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)

注：*AD組與正常老年組中同一蛋白含量的比值

2 結(jié)果

2.1蛋白質(zhì)譜鑒定及表達(dá)差異分析在正常老年組和AD組中共同鑒定到的蛋白質(zhì)有3071種，差異蛋白質(zhì)146種，與正常老年組相比，AD組中有62種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)(表1)和84種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)(表2)。

2.2蛋白質(zhì)功能聚類(lèi)分析結(jié)果如圖1所示。從生物學(xué)過(guò)程來(lái)說(shuō)，在146種差異蛋白質(zhì)中，有8%涉及細(xì)胞呼吸，14%涉及細(xì)胞代謝，兩者均與AD的能量代謝相關(guān)。根據(jù)分子功能注釋發(fā)現(xiàn)，結(jié)合功能和結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)蛋白所占比例較多。根據(jù)細(xì)胞成分注釋發(fā)現(xiàn)，其最主要的為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器相關(guān)蛋白，占50%，其中又以線粒體相關(guān)蛋白為主，與生物學(xué)過(guò)程中的細(xì)胞呼吸和代謝過(guò)程相吻合。

表 2 AD組與正常老年組腦組織表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)

續(xù)表 2 AD組與正常老年組腦組織表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)

注：*AD組與正常老年組中同一蛋白含量的比值

圖1兩組差異蛋白的GO功能分類(lèi)

表 3 各種生物過(guò)程相關(guān)蛋白質(zhì)的富集度分析

注：*富集分值最高的前7位；#每個(gè)分類(lèi)中所涉及到的基因數(shù)目

進(jìn)一步對(duì)參與各種生物過(guò)程的蛋白質(zhì)進(jìn)行富集度分析，結(jié)果顯示細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器及細(xì)胞呼吸和代謝相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)顯著富集(表3)。所有蛋白質(zhì)匹配到11條KEGG通路，可信度最高的通路為AD通路(匹配到通路中的基因?yàn)?個(gè)，P=0.0078)。在此通路中，基因轉(zhuǎn)錄翻譯的差異蛋白質(zhì)為：絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、NADH脫氫酶 (亞基Ⅵ、亞基Ⅹ)和細(xì)胞色素C氧化酶(COX；亞基Ⅰ、亞基Ⅱ、亞基Ⅲ和亞基Ⅳ)。

3 討論

AD主要的病理特征包括老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。神經(jīng)原纖維纏結(jié)是由細(xì)胞內(nèi)tau蛋白過(guò)度磷酸化所致。tau蛋白磷酸化與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路關(guān)系密切[8]。

MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是多種細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的重要傳遞者[9]，這類(lèi)激酶主要包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路、P38MAPK通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路和ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。其中ERK包括ERK1和ERK2，相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)分別為44 000和42 000,兩者的同源性為85%。MAPK/ERK信號(hào)通路有4條激活途徑，這些途徑的底物包括轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白、細(xì)胞內(nèi)其他重要的激酶以及K+通道等。這些物質(zhì)均是學(xué)習(xí)記憶形成的必要條件。

Feld等研究表明，ERK與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation，LTP)存在效應(yīng)關(guān)系，而LTP 和學(xué)習(xí)、記憶過(guò)程密切相關(guān)，被許多學(xué)者命名為“學(xué)習(xí)、記憶的突觸模型”，從而確定了ERK在學(xué)習(xí)記憶發(fā)生機(jī)制中的重要地位[10]。

在對(duì)可以引起學(xué)習(xí)記憶功能減退的AD研究中發(fā)現(xiàn)，ERK通路也發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)元的異常死亡是AD的常見(jiàn)現(xiàn)象。而在神經(jīng)元死亡的過(guò)程中，ERK的含量增加，一方面磷酸化胞漿底物,另一面進(jìn)行核轉(zhuǎn)移。核轉(zhuǎn)移的ERK發(fā)揮著促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用。這與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果AD患者的顳葉腦組織中ERK表達(dá)上調(diào)相吻合。但值得注意的是，在Subramaniam等[11]的研究中，ERK激活促進(jìn)神經(jīng)元的死亡與常規(guī)細(xì)胞凋亡形式有所不同，其細(xì)胞死亡的特點(diǎn)為壞死的胞膜損傷和凋亡樣核固縮，這提示ERK促進(jìn)神經(jīng)元死亡是一種非凋亡式的細(xì)胞死亡。

對(duì)于老年人，能量代謝異常引起神經(jīng)元死亡是導(dǎo)致AD的重要原因，這與該研究中與能量代謝相關(guān)的蛋白COX和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在疾病中表達(dá)降低的結(jié)果相吻合。

COX為線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ，是線粒體呼吸鏈電子傳遞的終末復(fù)合物，由13個(gè)蛋白亞基組成，蛋白亞基Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ由線粒體DNA編碼，其余10個(gè)蛋白亞基由核DNA編碼[12]。COX是位于線粒體內(nèi)膜上呼吸鏈末端的限速酶[13]，是線粒體呼吸鏈氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPH)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，把氧化還原反應(yīng)中的能量通過(guò)氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)楹吣芰姿徭I的ATP。該研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦組織COX表達(dá)顯著下降。這與既往研究結(jié)果相一致[14-16]，由此導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性改變，細(xì)胞線粒體能量代謝障礙，葡萄糖攝取和ATP產(chǎn)生減少。ATP輕微減少時(shí)導(dǎo)致氧化應(yīng)激性細(xì)胞損傷，當(dāng)其減少到不能滿足神經(jīng)元正常生理功能所需時(shí)，會(huì)引起神經(jīng)元功能異常,甚至細(xì)胞死亡。再者，AD患者細(xì)胞色素氧化酶表達(dá)降低，使線粒體呼吸鏈損傷，進(jìn)而導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加，而ROS又能激活β-分泌酶和γ-分泌酶，進(jìn)而促進(jìn)淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)分解為Aβ，而Aβ可損傷線粒體，進(jìn)一步導(dǎo)致 ROS 產(chǎn)生增加，形成惡性循環(huán)[17]。第三，Du等[18]研究表明，COX表達(dá)降低所致線粒體損傷可引起天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase) 依賴性途徑和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factors，AIFs) 參與的 caspae 非依賴性途徑，導(dǎo)致線粒體外膜破裂，引起鈣離子和一系列凋亡相關(guān)因子釋放，啟動(dòng)細(xì)胞的線粒體凋亡途徑?？傊?，COX表達(dá)下降可能是AD導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的機(jī)制之一。

另一種在細(xì)胞中與能量代謝相關(guān)的蛋白NADH，其為線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，Mr大約980 000，由45～46個(gè)蛋白亞基組成。NADH為介于三羧酸循環(huán)和線粒體內(nèi)膜之間的主要媒介物，參與細(xì)胞新陳代謝和能量反應(yīng)的重要輔酶。其功能主要有3方面:其一，NADH能夠加強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[19]，這主要通過(guò)清除和減少氧自由基對(duì)機(jī)體的組織細(xì)胞損傷起作用；其二，NADH參與細(xì)胞氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)組織細(xì)胞受體的表達(dá)和信號(hào)傳遞；第三，NADH作為參與能量代謝和呼吸鏈電子傳遞的重要輔酶，1分子NADH可產(chǎn)生3分子ATP，ATP耗竭可引起細(xì)胞死亡或凋亡[20]。該實(shí)驗(yàn)中，NADH在AD患者顳葉組織中表達(dá)降低，上述三方面的功能均受到影響，ATP生成減少，當(dāng)其減少至低于大腦神經(jīng)元維持正常生理功能所需閾值時(shí)，神經(jīng)元可能因ATP不足而引起細(xì)胞死亡或凋亡。神經(jīng)元死亡發(fā)生在顳葉、額葉和海馬等部位時(shí)，可促進(jìn)AD的進(jìn)展。

綜上，該研究應(yīng)用iTRAQ及2D LC-MS/MS技術(shù)，通過(guò)對(duì)正常老年人和AD患者尸檢顳葉腦組織差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩組中差異表達(dá)蛋白質(zhì)共146種，在疾病組中上調(diào)蛋白質(zhì)62種，下調(diào)84種，其中能匹配到可信度最高的AD通路中的蛋白質(zhì)有7種，概括為：表達(dá)上調(diào)的MAPK1、下調(diào)的NADH和COX。MAPK1在疾病中高表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)元的細(xì)胞死亡，而NADH和COX均為細(xì)胞呼吸鏈的組成成分，其表達(dá)下調(diào)，使線粒體呼吸鏈損傷，能量代謝障礙，引起神經(jīng)元功能異常或死亡。總之，這3種蛋白質(zhì)表達(dá)的變化均與AD的發(fā)生密切相關(guān)，這為AD疾病的預(yù)防或后續(xù)治療等相關(guān)研究提供了線索。

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