鮑曼不動桿菌及其耐藥基因的檢測

張小潔　肖春紅　袁建芬等

[摘要] 目的 探索一種檢測鮑曼不動桿菌及其耐藥基因的新方法。 方法 首先對近幾年醫(yī)院內鮑曼不動桿菌的耐藥情況進行分析，選擇臨床上治療鮑曼不動桿菌的首選藥，再采用聚合酶鏈反應對鮑曼不動桿菌及其突變株進行檢測。 結果 鮑曼不動桿菌對亞胺培南的耐藥率最低，為9.37%，OXA-51基因擴增結果與細菌培養(yǎng)相符，OXA-23基因擴增與鮑曼不動桿菌耐亞胺培南的結果相符。 結論 采用PCR法對OXA-51基因擴增可以檢測是否存在鮑曼不動桿菌，采用PCR法對OXA-23基因擴增可以檢測鮑曼不動桿菌是否存在亞胺培南耐藥性。從而快速檢測鮑曼不動桿菌及其耐藥基因，指導臨床用藥。

[關鍵詞] 細菌；耐藥性；聚合酶鏈反應；鮑曼不動桿菌

[中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）02-25-04

隨著抗生素的長期使用，耐藥菌不斷出現，特別是多重耐藥菌的出現已引起社會的廣泛重視。2011年初衛(wèi)生部專門發(fā)文要求各級醫(yī)院重視多重耐藥菌的監(jiān)測。而鮑曼不動桿菌（acinetobacter baumannii，Ab）是主要引起醫(yī)院感染的多重耐藥菌之一。鮑曼不動桿菌為條件致病菌，可引起多種臨床感染，其分離率在非發(fā)酵菌中僅次于綠膿假單胞菌，常導致嚴重的醫(yī)院感染如菌血癥、腦膜炎或肺炎。由于抗生素的過度使用，使得鮑曼不動桿菌產生多重耐藥[1-11]，甚至出現了泛耐藥株，且耐藥性呈逐年上升趨勢，已引起人們的關注。

鮑曼不動桿菌對青霉素類、頭孢菌素、環(huán)丙沙星、復方新諾明等耐藥率均超過80%，對亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦敏感性較高。目前主要采用培養(yǎng)方法[12]進行檢測，而其他檢測方法的臨床應用還未見。

本研究首先對近幾年醫(yī)院內鮑曼不動桿菌的耐藥情況進行分析，選擇臨床上治療鮑曼不動桿菌的首選藥，然后采用聚合酶鏈反應對鮑曼不動桿菌及其突變株進行檢測，同時采用培養(yǎng)法進行聯合檢測。以指導臨床用藥、防治院內感染的蔓延。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

從2009年6月～2011年12月本院患者送檢的標本（痰液、咽拭子、膿液、尿液、胸水、血液）中共分離到鮑曼不動桿菌32株（經德靈公司AUTO Scan4全自動細菌鑒定系統鑒定確認）。質控菌株包括金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 細菌藥物敏感紙片

哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、亞胺培南、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星均購自英國Oxoid公司。

1.3 主要試劑和儀器

AUTO Scan4全自動細菌鑒定系統（德靈公司）、ZF紫外透射反射分析儀（上?？等A生化器械廠）、Opticon 2 PCR擴增儀器（MJ公司）、GE-100電泳儀（杭州博日公司）。

MH瓊脂平板、血液瓊脂培養(yǎng)基干粉均購自杭州天和微生物試劑有限公司，直接DNA裂解液購自上海申友生物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 主要試劑的配制 （1）10×TBE緩沖液：稱取Tris 108g、硼酸55.0g，加入0.5mol/L EDTA（pH 8.0） 20mL定容至1000mL，在室溫下儲存。工作液為0.5×TBE緩沖液，加蒸餾水稀釋20倍即可。

1.4.2 細菌的培養(yǎng)、鑒定 按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版常規(guī)方法進行。根據菌落形態(tài)、革蘭染色和氧化酶等試驗，通過德靈公司的微生物鑒定系統的革蘭陰性菌GN卡鑒定為鮑曼不動桿菌。

1.4.3 藥物敏感試驗 采用紙片擴散（K-B）法。根據美國臨床實驗室標準化委員會（clinical laboratory standards institute，CLSI）2009年標準進行操作和判讀結果。

1.4.4 DNA的提取 采用蛋白酶K法：挑取血平板上純培養(yǎng)的單個菌落置入內含無菌生理鹽水（50μL）的0.2mL離心管中，濃度約為0.5麥氏單位，加入10μL蛋白酶K（200ng/mL）、50μL直接DNA裂解液，，55℃水浴0.5h，改100℃水浴10min，15000r/min離心30s，移液器吸取上清液。

1.4.5 PCR引物引物 OXA-51、OXA-23引物均由上海生工生物技術有限公司合成，擴增產物分別為353 bp 和1036 bp 的DNA 片段，

OXA-51基因引物參照郭萍[13]（鮑曼不動桿菌固有基因）：

引物1 5-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3引物2 5-TCCATTCCACTTCATCTTGG-3。

OXA-23基因引物參照鄒玖明[14]：引物1 5-GATGTGTCATAGTATTCGTCG-3引物2 5-TCACAACAACTAAAAGCACTG-3。

1.4.6 PCR擴增 在0.2mL無菌離心管中行加入25μL反應混合物，其終成份為50mmol/L KCl，10mmol/LTris-HCl（pH8.3），0.01%明膠，0.1%TritonX-100，1.5mmol/LMgCl2，各200μmol/L dNTPs，各0.2μmol/L引物1，2。再加入1μL Taq DNA聚合酶，最后加入5μL制備好的DNA模板，混勻離心數秒鐘。

熱循環(huán)參數為：94℃預變性5min，然后94℃ 50s，52℃ 40s，72℃90s，循環(huán)35周期，最后72℃延伸6min。

1.4.7 瓊脂糖電泳 在50mL 0.5×TBE中加入1g瓊脂糖，加熱溶解制得2%的瓊脂糖溶液。待溶液冷卻到55℃左右，加2μL溴化乙啶溶液（10mg/mL）；制成凝膠槽，放入盛有0.5×TBE緩沖液的電泳槽中，凝膠應完全被緩沖液覆蓋。取PCR擴增產物和DNA Marker進行瓊脂糖凝膠電泳，加樣量為每孔5μL，同時每個樣品用溴酚蘭作為指示劑，PCR擴增產物或者5μL DNA Marker，電泳電壓為120V，電泳時間為30min（可以看到溴酚蘭大約離加樣孔1cm處），在紫外反射儀上觀察結果。

2 結果

2.1 耐藥率

經x2檢驗，亞胺培南與其他藥物差異有統計學意義（P<0.05），哌拉西林/他唑巴坦與氨芐西林/舒巴坦之間差異無統計學意義（P>0.05），但與其他藥物差異有統計學意義（P<0.05）。試驗說明，鮑曼不動桿菌對亞胺培南的耐藥率最低，為9.37%。見表1。因此在本院應將亞胺培南作為治療鮑曼不動桿菌的首選藥。

3 討論

鮑曼不動桿菌及條件致病菌廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境中，被認為是院內感染的主要病原體之一，可引起菌血癥、呼吸機相關性肺炎等。本院近4年來鮑曼不動桿菌耐藥趨勢表明對亞胺培南耐藥率最低，對氨芐西林/舒巴坦和哌拉西林/三唑巴坦的耐藥率較低，均明顯低于其他受試抗菌藥物（表1），因此在本院應選亞培胺南類藥物作為治療鮑曼不動桿菌的首選藥。

鮑曼不動桿菌主要在住院患者標本中檢出，耐藥率逐年上升。而耐藥率的上升與鮑曼不動桿菌復雜的耐藥機制密切相關[15-16]，主要包括：產生抗生素純化酶、抗菌藥物作用靶位發(fā)生改變、細菌胞壁通透性改變及主動外排系統活性增強等[15-16]。這些耐藥機制可以單獨作用或協同作用，使鮑曼不動桿菌對抗菌藥物產生交叉耐藥和多重耐藥。β-內酰胺酶基因是鮑曼不動桿菌最主要的耐藥基因[17]，其余還有與喹諾酮類抗生素有關的DNA旋轉酶A亞單位基因（gyrA）、拓撲異構酶Ⅳ的C亞單位基因（parC）；與四環(huán)素類有關的Tet（A2E）、TetK、TetB、）TetM和TetO基因。亞培胺南是碳青霉烯類藥物，其產生耐藥主要與β-內酰胺酶基因產生突變有關。OXA-23型基因[14，18]屬于D類第二組中的2df亞組，主要存在于鮑曼不動桿菌中。OXA-23型酶水解碳青霉烯使菌株產生對亞胺培南類抗生素的耐藥性。本研究對耐亞胺培南的三株鮑曼不動桿菌OXA-23基因的PCR擴增證實了這一點。國內外[13，19]均有研究報道鮑曼不動桿菌的OXA-51屬于鮑曼不動桿菌的固有基因與其耐碳青霉烯類的關聯性不大，可用來檢測鮑曼不動桿菌。本研究對4析鮑曼不動桿菌的擴增也證實了這一點。

目前，國內外鮑曼不動桿菌的藥物敏感試驗仍以培養(yǎng)為主。這也是確診鮑曼不動桿菌的“金標準”，并且伴隨先進的全自動血培養(yǎng)儀器在國內三級醫(yī)院的逐漸普及，血培養(yǎng)在早期獲得病原體診斷能力上獲得顯著提高，血培養(yǎng)的價值獲得臨床上一致承認。然而，無論是先進的血培養(yǎng)儀器法還是傳統的手工培養(yǎng)方法，都是基于細菌的生長繁殖這一現象作為前期檢測條件，其本身具有難以克服的缺陷，主要表現為：采集前抗生素使用、樣本中細菌濃度低以及血液中的某些殺菌物質的作用等諸多因素所導致的培養(yǎng)陽性率低。因此培養(yǎng)在一定程度上仍然滿足不了臨床上快速診治和院內感染的需要。且鮑曼不動桿菌主要存在于痰液、咽拭子、膿液、尿液、胸水等標本中。因此必須快速檢測是否存在鮑曼不動桿菌，以治療患者，特別是防止院內感染的蔓延就成為一個緊迫的問題。而這就需要建立一個敏感性高、特異性好的方法來檢測鮑曼不動桿菌及其耐藥株。

而分子生物學技術迅速發(fā)展和病原體基因組研究的深入為快速診斷病原體提供有力的手段。以聚合酶鏈反應（PCR）為代表的分子生物學技術應用于病原體的診斷，極大縮短了病原體診斷時間，提高了病原體診斷的特異性和靈敏性。本研究通過分析本院的鮑曼不動桿菌的耐藥性情況，找到治療首選藥亞胺培南類藥物。再采用PCR擴增鮑曼不動桿菌OXA-51基因及耐亞胺培南藥有關的鮑曼不動桿菌OXA-23基因及時為臨床治療提供了指導，同時結合后繼的培養(yǎng)可以有效的防治鮑曼不動桿菌在醫(yī)院內的感染與流行。

[參考文獻]

[1] 馬序竹，呂媛.鮑曼不動桿菌對主要抗菌藥物耐藥機制[J].中國臨床藥理學雜志，2009，25（1）：90-94.

[2] Giamarellou H，Antoniadou A，Kanellakopoulou K.Acinetobacter baum annii：a universal threat to public health？ [J].International Journal of Antimicrobial Agents，2008，32（2）：106-119.

[3] 王倩，鄧宇欣，劉陽，等.鮑曼不動桿菌院內感染調查及耐藥分析[J].中國公共衛(wèi)生，2005，21（1）：111-112.

[4] 王喜仁，畢紅霞，谷東紅.我院常見非發(fā)酵革蘭陰性桿菌的分布和耐藥性分析[J].中國感染與化療雜志，2006，6（1）：45-47.

[5] 胡付品，葉信予，吳培澄，等.2005年上海華山醫(yī)院細菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志，2007，7（4）：233-237.

[6] Pimentel JD，Low J，Styles K，et al.Control of an outbreak of multi-drug-resistant acinetobacter baumannii in an intensive care unit and a surgical ward[J].J Hosp Infect，2005，59（3）：249-253.

[7] 周鐵麗，林小玲，馮紅軍，等.鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥機制研究[J].浙江檢驗醫(yī)學，2006，4（4）：4-8.

[8] 李新.鮑曼不動桿菌耐藥機制的研究進展[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2008，29（11）：1021-1023.

[9] 段金菊，劉卓拉，張潤梅，等.某院抗生素使用情況與耐藥性的關系[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2008，29（12）：1083-1087.

[10] Navon Venezia S，Leavitt A，Carmeli Y.High tigecycline resistance in multidrug resistantAcinetobacter baumannii[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2007，59（4）：772-774.

[11] 王金良.密切注視鮑曼不動桿菌的耐藥發(fā)展趨勢[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2005，28（4）：355-356.

[12] 程彥國，張軍民，趙莉萍，等.全自動血培養(yǎng)儀的臨床應用[J].中華醫(yī)學檢驗雜志，1999，22（2）：74-76.

[13] 郭萍，陳端，王輝，等.OXA-51樣D類碳青霉烯酶在鮑曼不動桿菌中廣泛分布[J].中華醫(yī)學檢驗雜志，，2007，30（5）：505-509.

[14] 鄒玖明，張愛平，李智山，等.OXA-23基因陽性耐亞胺培南鮑曼不動桿菌感染暴發(fā)調查研究[J].中國感染控制雜志，2010，9（4）：235-237.

[15] Griffjn MP，Morman JR.Toward the early diagnosis of neonatal sepsis and sepsis-like illness using novel heart rate analysis[J].Pediatrics，2001，107（1）：97-104.

[16] Livermore DM，Woodrd N.Carbapenemases：a problem in waiting？[J].Curr Opin Microbiol，2000，3（5）：489-495.

[17] Bush K，Jacoby GA.Updated Functional Classification ofβ-Lactamaded[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54（3）：969-976.

[18] Neil Woodford，Matthew J.Ellington，Juliana M.Coelho，et al. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2006，27（4）：351-353.

[19] Brown S，Young HK，Amyes SGB.Characterization of OXA-51：a novel class D caubapenemase found in geneticallyunrelated strains of Acinetobacter baumannii form Argentina[J].Clin Microbiol Infect，2005，11（1）：15-23.

（收稿日期：2013-09-26）

[11] 王金良.密切注視鮑曼不動桿菌的耐藥發(fā)展趨勢[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2005，28（4）：355-356.

[12] 程彥國，張軍民，趙莉萍，等.全自動血培養(yǎng)儀的臨床應用[J].中華醫(yī)學檢驗雜志，1999，22（2）：74-76.

[13] 郭萍，陳端，王輝，等.OXA-51樣D類碳青霉烯酶在鮑曼不動桿菌中廣泛分布[J].中華醫(yī)學檢驗雜志，，2007，30（5）：505-509.

[14] 鄒玖明，張愛平，李智山，等.OXA-23基因陽性耐亞胺培南鮑曼不動桿菌感染暴發(fā)調查研究[J].中國感染控制雜志，2010，9（4）：235-237.

[15] Griffjn MP，Morman JR.Toward the early diagnosis of neonatal sepsis and sepsis-like illness using novel heart rate analysis[J].Pediatrics，2001，107（1）：97-104.

[16] Livermore DM，Woodrd N.Carbapenemases：a problem in waiting？[J].Curr Opin Microbiol，2000，3（5）：489-495.

[17] Bush K，Jacoby GA.Updated Functional Classification ofβ-Lactamaded[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54（3）：969-976.

[18] Neil Woodford，Matthew J.Ellington，Juliana M.Coelho，et al. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2006，27（4）：351-353.

[19] Brown S，Young HK，Amyes SGB.Characterization of OXA-51：a novel class D caubapenemase found in geneticallyunrelated strains of Acinetobacter baumannii form Argentina[J].Clin Microbiol Infect，2005，11（1）：15-23.

（收稿日期：2013-09-26）

[11] 王金良.密切注視鮑曼不動桿菌的耐藥發(fā)展趨勢[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2005，28（4）：355-356.

[12] 程彥國，張軍民，趙莉萍，等.全自動血培養(yǎng)儀的臨床應用[J].中華醫(yī)學檢驗雜志，1999，22（2）：74-76.

[13] 郭萍，陳端，王輝，等.OXA-51樣D類碳青霉烯酶在鮑曼不動桿菌中廣泛分布[J].中華醫(yī)學檢驗雜志，，2007，30（5）：505-509.

[14] 鄒玖明，張愛平，李智山，等.OXA-23基因陽性耐亞胺培南鮑曼不動桿菌感染暴發(fā)調查研究[J].中國感染控制雜志，2010，9（4）：235-237.

[15] Griffjn MP，Morman JR.Toward the early diagnosis of neonatal sepsis and sepsis-like illness using novel heart rate analysis[J].Pediatrics，2001，107（1）：97-104.

[16] Livermore DM，Woodrd N.Carbapenemases：a problem in waiting？[J].Curr Opin Microbiol，2000，3（5）：489-495.

[17] Bush K，Jacoby GA.Updated Functional Classification ofβ-Lactamaded[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54（3）：969-976.

[18] Neil Woodford，Matthew J.Ellington，Juliana M.Coelho，et al. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2006，27（4）：351-353.

[19] Brown S，Young HK，Amyes SGB.Characterization of OXA-51：a novel class D caubapenemase found in geneticallyunrelated strains of Acinetobacter baumannii form Argentina[J].Clin Microbiol Infect，2005，11（1）：15-23.

（收稿日期：2013-09-26）