醫(yī)院環(huán)境中葡萄球菌誘導(dǎo)克林霉素耐藥及基因分析

董玉飛 趙紀維 李海娜 楊敬芳 許麗楓

葡萄球菌在自然界分布廣泛，主要寄生在哺乳動物和鳥類的皮膚、皮脂腺和黏膜。金黃色葡萄球菌致病力較強，常引起各種化膿性感染。由凝固酶陰性葡萄球菌引起的感染發(fā)病率也逐年增高，如表皮葡萄球菌為重要的機會致病菌和院內(nèi)感染重要的病原菌［1］。醫(yī)院環(huán)境中分布葡萄球菌屬細菌在一定條件下可以成為致病菌，引起院內(nèi)感染，或標本采集不當時污染細菌培養(yǎng)標本，了解醫(yī)院環(huán)境中葡萄球菌分布及耐藥性可為判斷院內(nèi)感染和分析臨床細菌培養(yǎng)結(jié)果提供參考。從而為合理使用抗生素提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 分離本院2010年3月至2011年10月醫(yī)院環(huán)境采樣標本中的葡萄球菌屬細菌210株，其中金黃色葡萄球菌16株，表皮葡萄球菌162株，其他凝固酶陰性葡萄球菌32株。用金黃色葡萄球菌ATCC25923做紙片法藥敏試驗質(zhì)控菌株。

1.2 材料MH瓊脂購自杭州天和微生物試劑有限公司，紅霉素、克林霉素、頭孢西丁等藥敏紙片購于溫州康泰生物科技有限公司，葡萄球菌鑒定卡是bioMerieux sa公司產(chǎn)品，ATCC25923是衛(wèi)生部北京醫(yī)院惠贈。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離與鑒定:按照醫(yī)院環(huán)境采樣標準采集醫(yī)院環(huán)境標本，常規(guī)操作菌落計數(shù)后，分離其中所有可疑葡萄球菌到血平板，進一步分離分純，采用ATB Expression鑒定系統(tǒng)及其配套鑒定卡32 staph鑒定到種。

1.3.2 MH平板制備:按照說明書要求稱量干粉溶于蒸餾水中加熱溶解后，121℃高壓15 min，45℃水浴平衡后，取一次性無菌培養(yǎng)皿在超凈工作臺中水平儀上每平皿注入24 ml，冷卻待用。

1.3.3 藥敏試驗:采用k-b瓊脂擴散法檢測紅霉素15 μg、克林霉素2 μg、頭孢西丁30 μg耐藥性，試驗方法及結(jié)果判讀按照CLSI2010M100-S20執(zhí)行。紅霉素抑菌圈≥23敏感，14-22中介，≤13耐藥?？肆置顾亍?1敏感，15-20中介，≤14耐藥。金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌頭孢西丁30 μg≤21為MRS，≥22為MSS。凝固酶陰性葡萄球菌頭孢西丁30μg≤24為MRCNS，≥25為MSCNS。

1.3.4 D試驗檢測:采用k-b瓊脂擴散法依據(jù)CLSI2010M100-S20進行，把傳純18～24 h的菌落用無菌生理鹽水配制成0.5麥氏單位濁度，均勻涂布在MH平板上，將紅霉素15 μg、克林霉素2 μg紙片貼到平板上，兩紙片中心間距15～26 mm，35℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h觀察結(jié)果。與紅霉素相鄰的克林霉素抑菌圈邊緣出現(xiàn)“截平”即D試驗陽性。無截平時判為陰性。

1.3.5 erm基因檢測:①模板DNA的制備:取在血平板上培養(yǎng)過夜的菌落用1.8 ml 0.9%氯化鈉溶液制備4個麥氏單位菌懸液。12 000 r/min離心5 min，去上清加入200 μl的裂解緩沖液(1%TritonX-100，10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA)，金屬浴器中100℃10 min后，12 000 r/min離心5 min，取上清液保存于-20℃?zhèn)溆?。②PCR引物及PCR反應(yīng):根據(jù)文獻分別合成用于紅霉素核糖體甲基化酶基因擴增的引物，ermA正向引物:GTTCAAGAACAATCAATACAGAG及反向引物:GGATCAGGAAAAGGACATTTTAC;ermB正向引物:CCGTTTACGAAATTGGAACAGGTAAAGGGC及反向引物:GAATCGAGACTTGAGTGTGC;ermC正向引物:AGTACAGAGGTGTAATTTCG及反向引物:AATTCCTGCATGTTTTAAGG。PCR反應(yīng)條件分別參考相應(yīng)文獻［5，6］。③瓊脂糖凝膠電泳分離，取8 μLPCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，ermA，ermB，ermC。

2 結(jié)果

2.1 葡萄球菌菌屬細菌分布 醫(yī)院環(huán)境中210株葡萄球菌，其中金黃色葡萄球菌16株，表皮葡萄球菌162株，其他凝固酶陰性葡萄球菌32株。來自空氣采樣標本的6株(表皮葡萄球菌2株，溶血葡萄球菌2株，人葡萄球菌2株)，物體表面及消毒液標本中68株(表皮葡萄球菌58株，人葡萄球菌4株，金黃色葡萄球菌2株，溶血葡萄球菌2株，頭狀葡萄球菌2株)，工作人員手表面采樣標本136株(表皮葡萄球菌92株，金黃色葡萄球菌14株，溶血葡萄球菌8株，人葡萄球菌4株，模仿葡萄球菌2株，木糖葡萄球菌2株，耳葡萄球菌2株，頭狀葡萄球菌2株)。16株金黃色葡萄球菌中MRSA6株(6/16，37.50%);MSSA10株(10/16，62.50%);162株表皮葡萄球菌中MRSE150株(150/162，92.59%);MSSE12株(12/162，7.40%);32株其他凝固酶陰性葡萄球菌中MRCNS24株(24/32，75.00%);MSCNS8株(8/32，25.00%)。見表1。

表1 醫(yī)院環(huán)境標本葡萄球菌屬細菌分布 株

2.2 耐藥性及D實驗陽性分布210株葡萄球菌中紅霉素耐藥克林霉素耐藥共62株，占29.52%，紅霉素敏感克林霉素敏感29株，占13.81%，紅霉素耐藥或中介克林霉素敏感或中介119株，占56.67%，其中D試驗陽性82株，占39.05%，D試驗陰性37株，占17.62%。6株MRSA中紅霉素耐藥克林霉素耐藥、紅霉素敏感克林霉素敏感、紅霉素中介或耐藥克林霉素中介或耐藥分別為2株，占33.33%，1株，占16.67%，3株，占50%，其中D試驗陽性3株占50.00%，D試驗陰性0株;10株MSSA中紅霉素耐藥克林霉素耐藥、紅霉素敏感克林霉素敏感、紅霉素中介或耐藥克林霉素中介或耐藥分別為4株，占40.00%，1株，占10.00%，5株，占50.00%，其中D試驗陽性4株，占40.00%，D試驗陰性1株，占10.00%;150株MRSE中紅霉素耐藥克林霉素耐藥、紅霉素敏感克林霉素敏感、紅霉素中介或耐藥克林霉素中介或耐藥分別為46株，占30.67%，17株，占11.33%，87株，占58.00%，其中D試驗陽性61株，占40.67%，D試驗陰性26株，占16.67%;12株MSSE中紅霉素耐藥克林霉素耐藥、紅霉素敏感克林霉素敏感、紅霉素中介或耐藥克林霉素中介或耐藥分別為3株，占25.00%，3株，占25.00%，6株，占50.00%，其中D試驗陽性4株，占33.33%，D試驗陰性2株，占16.67%;24株甲氧西林耐藥的其他凝固酶陰性葡萄球菌中紅霉素耐藥克林霉素耐藥、紅霉素敏感克林霉素敏感、紅霉素中介或耐藥克林霉素中介或耐藥分別為6株，占25.00%，4株，占16.67%，14株，占58.33%，其中D試驗陽性9株，占37.50%，D試驗陰性5株，占20.83%;8株甲氧西林敏感其他凝固酶陰性葡萄球菌中紅霉素耐藥克林霉素耐藥、紅霉素敏感克林霉素敏感、紅霉素中介或耐藥克林霉素中介或耐藥分別為1株，占12.50%，3株，占37.50%，4株，占50.00%，其中D試驗陽性1株，占12.50%，D試驗陰性3株，占37.50%。見表2。

表2 醫(yī)院環(huán)境葡萄球菌對紅霉素克林霉素耐藥性及D實驗陽性分布株(%)

2.3 82株D-實驗陽性菌株檢測紅霉素核糖體甲基化酶基因 其中ermC為主，占56.09%(46/82)，ermA和ermB分別占9.7%(8/82)和15.85%(13/82)。未檢出占23.17%(19/82)。D實驗陽性的65株表皮葡萄球菌中28株檢出ermC，3株檢出ermB+C，占47.69%(31/65)。見表3。

表3 82株D-實驗陽性菌株檢測紅霉素核糖體甲基化酶基因株

3 討論

醫(yī)院環(huán)境中葡萄球菌分布廣泛，耐藥性比其他一般環(huán)境中嚴重，隨著細菌分離鑒定技術(shù)的提高，葡萄球菌屬細菌引起院內(nèi)感染及造成微生物標本污染所占比例越來越大［1］。醫(yī)務(wù)人員的操作不當及環(huán)境消毒不嚴格，極易造成院內(nèi)感染或污染采集的標本，增加患者的經(jīng)濟和精神負擔。嚴格執(zhí)行醫(yī)院消毒技術(shù)規(guī)范非常重要，但基層醫(yī)院較容易忽略病房及陪護人員、醫(yī)護人員日用品消毒處理，不經(jīng)意間造成傳播。在聽診器表面、喉鏡表面、醫(yī)務(wù)人員手表面分離率高，本文針對醫(yī)院環(huán)境中葡萄球菌對紅霉素和克林霉素耐藥性及誘導(dǎo)克林霉素耐藥做出初步研究。

大環(huán)內(nèi)酯類、林可酶素類和鏈陽酶素類是3類功能密切相關(guān)但結(jié)構(gòu)不同的抗生素，這些抗生素常共同地被稱為MLS群，MLS群抗生素在核糖體水平可抑制敏感微生物蛋白質(zhì)合成。在葡萄球菌中獲得性對大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類耐藥很流行［3-6］。對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥有兩個不同的機制，(1)主動外排，由msrA基因編碼，引起對大環(huán)內(nèi)酯類和B型鏈陽霉素耐藥(但不耐克林霉素)，稱為MS表型:即紅霉素耐藥，克林霉素敏感。(2)核糖體靶位改變，由erm基因編碼，引起對大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類和B型連陽霉素耐藥(MLSb耐藥)。Erm基因可編碼產(chǎn)生甲基化酶，此酶可減低藥物與rRNA靶位的結(jié)合。若erm基因穩(wěn)定表達，則表現(xiàn)對紅霉素、克林霉素和其他MLS群成員耐藥，稱為MLSb固有表型:即紅霉素耐藥，克林霉素耐藥。然而在某些情況下，erm基因需要誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)才能表達對克林霉素耐藥，否則體外試驗可能會表現(xiàn)為對克林霉素敏感，紅霉素可作為這種誘導(dǎo)劑。這些分離菌株在體外表現(xiàn)對紅霉素耐藥而對克林霉素敏感，稱為MLSb誘導(dǎo)表型:即紅霉素耐藥，克林霉素敏感［1］。

誘導(dǎo)耐藥性與紅霉素核糖體甲基化酶erm基因有關(guān)，ermA定位在Tn554轉(zhuǎn)座子，ermC定位在質(zhì)粒，它們是葡萄球菌對MLSB類抗生素耐藥的主要基因。ermB較少見，主要從動物分離菌株中檢測到。據(jù)文獻報道，ermA是70年代以前金黃色葡萄球菌對紅霉素耐藥的主要決定基因，但此后ermC則取代ermA成為主要耐藥基因［3］。本實驗所測erm基因以ermC為主，占誘導(dǎo)耐藥菌株(D Test陽性)的56.09%(46/82)，低于文獻報道［3，4］。

1 陳東科孫長貴主編.實用臨床微生物學(xué)檢驗與圖譜.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011，231.

2 李仲興，趙建宏，楊敬芳主編.革蘭陽性球菌與臨床感染.第1版.北京:科學(xué)出版社，2007.141.

3 沈定霞，羅燕萍，徐雅萍，等.葡萄球菌對紅霉素和克林霉素誘導(dǎo)耐藥性研究中.中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，2005，28:400-402.

4 賈偉，趙志軍，楊曉燕，等.葡萄球菌對克林霉素誘導(dǎo)耐藥表型及基因型檢測研究.分子診斷與治療雜志，2010，2:94-97.

5 Lina G，Quaglia A，Reverdy ME，et al.Distribution of genesencoding resistance tomacrolides，lincosamides，and streptograminsamong staphylococc.i Antimicrob Agents Chemother，1999，43:1062-1066.

6 Khan SA，NawazMS，Khan AA，et al.Simultaneous detection of erythromycin-resistant methylase genes erm A and ermC fromStaphylococcus spp bymultiplex-PCR.Mol Cell Probes，1999，13:381-387.