靶向Akt1基因RNA干擾對胸主動脈平滑肌細胞增殖的影響

劉蘇健 范波 丁明超 王意忠 王斌

近年來，動脈硬化及其閉塞性血管疾病的發(fā)生率迅速升高，自體靜脈移植是治療外周血管疾病的有效手段。然而移植血管中膜平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向內(nèi)膜遷移、過度增殖和細胞外基質(zhì)大量合成是導致血管移植術(shù)后移植靜脈內(nèi)膜增厚、管腔狹窄的重要原因［1］。如何防治血管內(nèi)膜增生一直是困擾血管外科醫(yī)師的臨床難題。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是在轉(zhuǎn)錄后水平使得靶基因mRNA降解，從而使得目的基因表達減少或沉默［2］。本研究針對PI3K-Akt-mTOR信號通路中關鍵信號因子Akt亞型Akt1進行RNA干擾，通過分子生物學技術(shù)觀察其抑制平滑肌細胞增殖的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 質(zhì)粒pGenesil-1和感受態(tài)大腸桿菌DH-5α購自武漢晶賽生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基(Dulbcco's Modified Eagle Medium)和新生牛血清購自美國Gibco公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、PstⅠ和T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Annexin V-PE購自Bender Medsystems公司。

1.2 方法

1.2.1 基因序列:利用Invitrogen網(wǎng)站(www.invitrogen.com)提供的設計工具設計目的靶基因兔Akt1 mRNA序列，依照shRNA設計原則，設計并合成4條shRNA片段，退火形成雙鏈后進行酶切和測序，經(jīng)預實驗后挑選出2條有效地Akt1 shRNA真核表達載體，一條為5’-GGGACUAGACCAUAAUCCATA-3’，另外一條為5’-CCTGGCUGACUUGAAUAUGTT-3’，陰性對照(錯配質(zhì)粒shRNA)序列為5’-UUAGACCUCTGGUUCGUACTT-3’，確保選擇的shRNA與其他基因序列至少存在3個以上的堿基不同［3］。

1.2.2 合成shRNA序列DNA單鏈并測序:每條靶序列設計并合成所編碼shRNA的DNA前向和反向序列單鏈，經(jīng)退火形成雙鏈后成與相應的黏性末端連接;再次退火連接、載體pGenesil-1質(zhì)粒線性化處理及回收、稀釋退火片段，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。經(jīng)測序鑒定無誤后命名為Akt1-shRNA-1和Akt1-shRNA-2。

1.2.3 分組及轉(zhuǎn)染:該課題設置空白對照組(A組)、陰性對照組(B組)，Akt1-shRNA-1(C組)，Akt1-shRNA-2(D組)。原代培養(yǎng)的第3代日本大耳白兔胸主動脈平滑肌細胞于轉(zhuǎn)染前1 d接種于6孔板中，用2 ml含10%無抗新生牛血清的培養(yǎng)基定量;置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時，按Lipofectamine2000操作步驟仔細操作，將DNA與Lipofectamine2000溶于無血清無抗的DMEM培養(yǎng)基中，將兩者吹打后混勻;室溫下孵育15～20 min，將混勻的轉(zhuǎn)染試劑用移液器加入到6孔板中，48 h觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 FCM檢測細胞凋亡:將原第3代兔胸主動脈細胞接種于6孔板中，細胞爬滿玻璃片后Lipofectamine2000脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細胞:加入結(jié)合緩沖液分別兩次懸浮平滑肌細胞，將細胞懸液移入5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V-PE和10 μl 7-AAD，室溫孵育15 min后加緩沖液至500 μl;流式細胞儀分析，凋亡細胞所占總細胞比例即為凋亡率，實驗重復三次，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h處理細胞。

1.2.5 TUNEL檢測平滑肌細胞凋亡程度:將細胞接種于6孔板中，置孵育箱中培養(yǎng)，使細胞密度達到90%～100%。Lipofectamine2000脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染平滑肌細胞，培養(yǎng)6 h后給予換液，按TUNEL試劑盒操作步驟進行操作，分別加入50 μl TUNEL液和50 μl轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒中孵育30 min。PBS沖洗3次，加入200 μl DAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次后封片，在光鏡下分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兔平滑肌細胞原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)5～7 d后給予更換DMEM培養(yǎng)液，可見少量平滑肌細胞從組織塊邊緣游出(圖1);10～13 d可見組織塊邊緣有明顯的平滑肌細胞聚集，細胞呈帶狀、長梭狀(圖2);采用α-SM-actin對兔原代培養(yǎng)平滑肌細胞進行細胞學鑒定，見圖3。

圖1 原代培養(yǎng)5 d的平滑肌細胞，可見組織塊邊緣有小的平滑肌細胞游出

圖2 培養(yǎng)12 d的平滑肌細胞，呈現(xiàn)特征性“峰”“谷”生長

圖3 α-SM-actin染色，陽性呈棕黃色(TUNEL×400)

2.2 兔平滑肌細胞轉(zhuǎn)染效率 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第3代平滑肌細胞于48 h后在熒光顯微鏡下觀察，兩人分別同時計數(shù)相同視野下綠色熒光細胞與光學顯微鏡下細胞總數(shù)，重復三次后取其平均值。見圖4。

圖4 平滑肌細胞轉(zhuǎn)染48 h熒光照片，轉(zhuǎn)染細胞呈綠色，48 h轉(zhuǎn)染率為17.8%(TUNEL×200)

2.3 流式細胞儀計算細胞凋亡數(shù)目 實驗結(jié)果表明24 h Akt1-shRNA-1和Akt1-shRNA-2組細胞凋亡率分別為15.97%和12.47%，在48 h凋亡率分別達到19.72%和15.43%，抑制增殖效果達到最高峰，轉(zhuǎn)染組與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，之后抑制增殖效果趨于平緩;A組與B組相比凋亡細胞數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖5、6。

2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡數(shù)目Lipofectamine2000脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染第3代兔胸主動脈平滑肌細胞，轉(zhuǎn)染后48 h用多聚甲醛固定平滑肌細胞，TUNEL法檢測細胞凋亡，轉(zhuǎn)染組與對照組相比細胞凋亡明顯增多(P＜0.05)。TUNEL結(jié)果顯示C組和D組均促進凋亡的發(fā)生，以C組較為明顯。見圖7、8。

圖5 各時間點流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡直方圖，A為空白對照組、B為陰性對照組，C為Akt1-shRNA-1，D為Akt1-shRNA-2。*為與A組和B組相比P＜0.05，各時間點A組與B組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)

圖6 流式細胞術(shù)檢測48 h細胞凋亡示意圖

圖7 兔血管平滑肌細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h結(jié)果(TUNEL×100)

圖8 TUNEL檢測凋亡直方圖。A為空白對照組、B為陰性對照組，C為Akt1-shRNA-1，D為Akt1-shRNA-2

3 討論

隨著社會的發(fā)展，血管閉塞性疾病越來越給老年患者帶來痛苦，而除介入操作外血管搭橋術(shù)可解決血管外科大部分疾病的困擾，而血管移植術(shù)后再狹窄的主要原因之一是血管中膜平滑肌細胞的增殖和向內(nèi)膜遷移［2］。新生內(nèi)膜增生開始于靜脈移植術(shù)后的早期，并最終可能導致移植血管管腔狹窄或閉塞［3］。血管移植術(shù)后移植血管再狹窄的發(fā)生機制十分復雜，多種細胞因子、生長因子、血管活性物質(zhì)參與已得到證實［4，5］。PKB(Akt)是PI3K-Akt-mTOR信號通路系統(tǒng)中一個重要信號位點，是調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的重要信號分子;Akt家族包括Aktl，Akt2，Akt3三個亞類，它們的結(jié)構(gòu)相似但功能截然不同，Aktl可能參與調(diào)控細胞生長和生存［6］。激活的Akt通過促進下游靶位點如(mTOR)等磷酸化而發(fā)揮其廣闊的生物學效應。通過影響信號通路來防治VSMC的增殖和促進其凋亡是近年來血管外科領域基因研究的熱點。

RNAi技術(shù)有其獨特的優(yōu)點即高效性、高特異性和可遺傳性。目前已進行的一些哺乳動物細胞實驗中應用RNAi技術(shù)表明其可有效地抑制細胞靶基因的表達。目前尚未見有關利用RNAi技術(shù)抑制Akt1基因表達的文獻報道。本課題組應用RNAi技術(shù)抑制VSMCs Akt1基因的表達。通過Lipofectamine2000將shRNA轉(zhuǎn)染入原代培養(yǎng)的兔胸主動脈平滑肌細胞內(nèi)，利用熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示脂質(zhì)體成功地將shRNA轉(zhuǎn)染入原代培養(yǎng)兔胸主動脈平滑肌細胞內(nèi)，48 h轉(zhuǎn)染率為17.8%;應用流式細胞術(shù)于24、48、72、96 h檢測shRNA抑制平滑肌細胞增殖，結(jié)果顯示shRNA轉(zhuǎn)染后試驗組細胞凋亡數(shù)目增加，48 h凋亡率最高，之后隨著時間延長凋亡細胞逐漸減少。上述結(jié)果分別從蛋白和細胞水平驗證了針對Akt1的shRNA有效地抑制了兔原代培養(yǎng)血管平滑肌細胞的增殖，為下一步試驗奠定了基礎。

1 Payeli SK，Latini R，Gebhaed C，et al.Prothrombotic gene expression profile in vascular smooth muscle cells of human saphenous vein，but not internal mammary artery.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28:705-710.

2 Werth D，Grassi G，Konjer N，et al.Proliferation of human primary vascular smooth muscle cells depends on serum response factor.Eur J Cell Biol，2010，89:216-224.

3 劉蘇健，劉宏，趙京，等.大鼠Pik3cb短發(fā)卡狀RNA對平滑肌細胞增殖的影響.南京醫(yī)科大學學報.2008，28:1234-1239.

4 Scott NA.Restenosis following implantation of bare metal coronary stents:pathophysiology and pathways involved in the vascular response to injury.Adv Drug Deliv Rev，2006，58:358-376.

5 Chapman MJ.From pathophysiology to targeted therapy for atherothrombosis:A role for the combination of statin and aspirin in secondary prevention.Pharmacol Ther，2007，113:184-196.

6 Song G，Ouyang G，Bao S.The activation of Akt/PKB signaling pathway and survival.J Cell Med，2005，9:59-71.