淫羊藿配合髓芯減壓術(shù)治療兔激素性股骨頭壞死的實驗研究

劉志國 馬文海 李杰

股骨頭壞死(femoral head necrosis)是由不同病因引起的股骨頭活力成分死亡的病理過程，臨床以髖關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙為主要癥狀。該病起病隱匿，病程長，預(yù)后差，一旦發(fā)生塌陷，多發(fā)展為髖關(guān)節(jié)的退行性關(guān)節(jié)病，是骨科治療上的疑難重癥。激素性股骨頭壞死(steroid-induced femoral head necrosis)是腎上腺皮質(zhì)類固醇藥物性股骨頭壞死的簡稱，為非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中最為常見的類型，隨著臨床大量激素藥物的應(yīng)用，其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢。目前，手術(shù)與中醫(yī)藥治療各有利弊，探討如何將西醫(yī)手術(shù)和中醫(yī)藥的治療優(yōu)勢有機結(jié)合，尋求一種療效確切，費用低廉，副作用少的綜合療法，對于提高治療激素性股骨頭壞死的療效，減輕患者和社會經(jīng)濟負擔(dān)具有重要意義。本研究應(yīng)用中藥淫羊藿配合髓芯減壓術(shù)治療動物激素性股骨頭壞死，觀察該療法對股骨頭骨組織再生的影響，揭示其治療激素性股骨頭壞死的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 純種健康成年雄性新西蘭大白兔60只，年齡5～6個月，體重2.5～3.5 kg，由白求恩國際和平醫(yī)院動物實驗室提供［批號:SYXK-(軍)2012-017］，屏蔽環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器及試劑 馬血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)，甲基強的松龍(美國輝瑞生物制藥公司)，中藥淫羊藿成品(貴州同仁堂藥業(yè)有限公司)，Trizol試劑、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，PCR引物(上海生工)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI Fermentas公司)，兔抗BMP-2多克隆抗體和兔抗IGF1多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(sigma公司，美國)，OMNI TH組織均質(zhì)儀(美國OMNI公司)，PCR儀(德國Effendorf公司)，水平電泳儀(美國Bio-Rad公司)，垂直電泳儀(北京市六一儀器廠)，半干電轉(zhuǎn)儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，柯達計算機X線攝影成像系統(tǒng)(900 CR)，Lunar prodigy型雙能X線骨密度儀(美國GE公司)，INSTRON 5544材料性能實驗機(美國instron公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制作及分組:將動物隨機分為對照組(n=12)和模型組(n=48)。按照Wang等［1］造模方法造模，兔耳緣靜脈注射馬血清10 ml/kg，間隔3周后，馬血清量減為6 ml/kg，經(jīng)兔耳緣靜脈再次注射，間隔2周后，腹腔注射甲基強的松龍45 mg/kg，1次/d，連續(xù)3 d。注射激素期間，每只動物每次腹腔注射青霉素10萬U，1次/d，連續(xù)7 d，預(yù)防感染。經(jīng)X線檢測證實造模成功后，將模型動物隨機分為模型組、手術(shù)組(髓芯減壓術(shù))、中藥組(淫羊藿)、綜合組(隨芯減壓術(shù)+淫羊藿)，每組12只。

1.3.2 動物處理:手術(shù)組:采用髓芯減壓術(shù)治療。俯臥于手術(shù)臺上，局部備皮后消毒，沿大轉(zhuǎn)子切開皮膚皮下，分離肌肉及骨膜，在大轉(zhuǎn)子上用2 mm細鉆頭向股骨頭內(nèi)鉆孔，以不越過股骨頭軟骨面為界。徹底清除髓腔后關(guān)閉切口，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素10萬U預(yù)防感染，1次/d，共1周。中藥組:將淫羊藿加水文火煎熬至生藥質(zhì)量濃度為1 g/ml，每天給予淫羊藿熬制液6 ml/kg喂養(yǎng)，觀察其均能在10 min內(nèi)喝完，連續(xù)8周。綜合組:在做髓芯減壓術(shù)的基礎(chǔ)上配合喂養(yǎng)淫羊藿。

術(shù)后10周末，將所有動物氯胺酮復(fù)合麻醉后，備皮、消毒、固定。嚴格無菌手術(shù)下，取出雙側(cè)股骨頭，經(jīng)DEPC處理的PBS液沖洗后，一側(cè)股骨頭放入液氮中凍存，用于PCR及Western blot檢測。另一側(cè)用于生物力學(xué)檢測。

1.3.3 X線檢查:于最后1次激素注射后4周末，2組各取6只動物，氯胺酮復(fù)合麻醉(安定3.5 mg/kg肌內(nèi)注射15 min后，氯胺酮25 mg/kg肌內(nèi)注射)后，拍雙髖正位X線片。

1.3.4 生物力學(xué)檢測:將股骨頭標本固定在材料性能實驗機的夾具內(nèi)垂直加壓。平穩(wěn)加載速度控制在2 mm/min，實驗儀內(nèi)的計算機自動記錄位移應(yīng)變等數(shù)據(jù)由Merlin軟件實驗檢測系統(tǒng)采集。

1.3.5 RT-PCR:采用高速均質(zhì)儀進行組織粉碎處理，按Trizol試劑盒的說明要求，提取總RNA，并用DNA酶處理總RNA，瓊脂糖凝膠電泳確定RNA未降解，紫外分光光度計測定濃度。使用RT試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因的表達。目的基因檢測所用引物見表1。

表1 目的基因檢測所用引物

1.3.6 Western blot:于粉末狀骨組織中加入PIPA裂解液，提取總蛋白，BCA法測定濃度，取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。膜先在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入一抗(IGF1 1∶200;BMP-2 1∶500稀釋)，4℃雜交過夜。將膜轉(zhuǎn)移到辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體中(1∶10 000稀釋)，室溫雜交1 h。將膜置于化學(xué)發(fā)光液中，曝光、顯影及定影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，行單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用獨立性t檢驗，兩變量之間的關(guān)系采用相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X線檢查結(jié)果 正常對照組股骨頭形態(tài)完整，關(guān)節(jié)面清晰，股骨頭骨密度均勻;模型組股骨頭關(guān)節(jié)面模糊，可見骨密度減低，囊性變，骨硬化等表現(xiàn)。見圖1。

圖1 2組注射激素后4周雙側(cè)X線表現(xiàn)

2.2 IGF1和BMP-2 mRNA、蛋白的表達IGF1mRNA和蛋白水平，模型組顯著高于對照組(P＜0.05)，可能是機體的自發(fā)修復(fù)反應(yīng)促使其表達升高。BMP-2 mRNA和蛋白水平，模型組較對照組明顯下降(P＜0.05)。IGF1、BMP-2 mRNA和蛋白的表達，中藥組與綜合組，手術(shù)組與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而兩者在中藥組和綜合組的表達顯著高于模型組和手術(shù)組(P＜0.05)。并且，IGF1與BMP-2 mRNA(r=0.706，P＜0.01)及蛋白(r=0.792，P＜0.01)在股骨頭的表達呈明顯正相關(guān)。見表2、3，圖2、3。

表2 股骨頭骨組織中IGF1/GAPPH和BMP-2mRNA的表達情況n=12，±s

表2 股骨頭骨組織中IGF1/GAPPH和BMP-2mRNA的表達情況n=12，±s

注:與對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01;與手術(shù)組比較，△P＜0.01

組別BMP-2/GADPHmRNAIGF1/GADPHmRNA模型組0.769±0.093*1.029±0.082*1.491±0.0820.563±0.067手術(shù)組0.876±1.107*1.057±0.093*中藥組1.164±0.104*#△1.301±0.087*#△綜合組1.157±0.096*#△1.387±0.095*#△對照組

表3 股骨頭骨組織中PFGH和BMP-2蛋白的表達情況n=12，±s

表3 股骨頭骨組織中PFGH和BMP-2蛋白的表達情況n=12，±s

注:與對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01;與手術(shù)組比較，△P＜0.01

組別IGF1/GADPH蛋白BMP-2/GADPH 蛋白模型組0.551±0.091*0.437±0.082*0.419±0.0830.959±0.093手術(shù)組0.578±0.089*0.453±0.078*中藥組0.845±0.103*#△0.705±0.103*#△綜合組0.907±0.107*#△0.737±0.099*#△對照組

圖2 RT-PCR檢測股骨頭組織中IGF1和BMP-2mRNA的表達

圖3 Western blot檢測股骨頭骨組織中IGF1和BMP-2蛋白的表達

2.3 骨密度 與對照組比較，模型組骨密度明顯下降(P＜0.01)。中藥組、手術(shù)組、綜合組均較模型組有所改善(P＜0.05或＜0.01)，其中綜合組改善效果明顯好于中藥組和手術(shù)組(P＜0.05)。見表4。

表4 5組股骨頭骨密度的改變n=12，g/cm2，±s

表4 5組股骨頭骨密度的改變n=12，g/cm2，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，☆P＜0.01;與綜合組比較，▲P＜0.05

組別 骨密度值綜合組0.265±0.021＊☆0.276±0.027中藥組0.229±0.025#△▲手術(shù)組0.215±0.029#△▲模型組0.161±0.023#對照組

2.4 生物力學(xué)測定結(jié)果 與對照組比較，模型組骨結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)抗壓強度、剛度均明顯下降(P＜0.05或＜0.01);中藥組、手術(shù)組、綜合組均較模型組有不同程度改善(P＜0.05或＜0.01)，其中綜合組改善效果明顯好于中藥組和手術(shù)組(P＜0.05)。見表5。

表5 5組生物力學(xué)參數(shù)測定n=12，±s

表5 5組生物力學(xué)參數(shù)測定n=12，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，☆P＜0.01;與綜合組比較，▲P＜0.05

組別 抗壓強度(N)剛度(N/mm)綜合組922±109＊△839±66＊☆964±117882±64中藥組860±122＊△▲741±72#△▲手術(shù)組836±133＊△▲726±58#△▲模型組778±128*672±50#對照組

3 討論

激素性股骨頭壞死占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位，并有逐年增高的趨勢。建立股骨頭壞死的動物模型對探索成功的治療模式是必不可少的。用馬血清致動物出現(xiàn)Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)，即抗原抗體復(fù)合物沉積在血管壁上引起超敏性血管炎，此后應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可抑制膠原和彈性纖維的合成，進而導(dǎo)致小動脈斷裂或栓塞，髓內(nèi)出血，最終導(dǎo)致股骨頭壞死。同時，激素誘導(dǎo)骨髓脂肪化，脂肪細胞增生肥大，成骨細胞減少，髓內(nèi)壓升高，血管受壓，脂肪損害血管內(nèi)皮細胞，局部血栓形成，或脂肪栓塞進一步導(dǎo)致骨壞死的發(fā)生。本實驗參照Wang等［1］的方法，用改進的馬血清加甲基強的松龍的方法誘導(dǎo)制備兔激素性股骨頭壞死動物模型，其影像學(xué)改變符合臨床典型的股骨頭壞死的特征，且具有簡便、動物死亡率低、成功率高等優(yōu)點。

近年研究者發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是骨基質(zhì)中的重要生長因子之一，其作為一種自分泌調(diào)節(jié)因子而影響骨骼形成和成骨細胞的功能，它們可由骨骼細胞分泌，具有調(diào)節(jié)骨保護素，抑制破骨細胞的分化成熟，減少骨吸收，系統(tǒng)調(diào)節(jié)促進骨形成和骨吸收的偶聯(lián)，加速骨轉(zhuǎn)化的作用。IGF1還可刺激骨骼Ⅰ型膠原蛋白合成及加快骨基質(zhì)的沉積速度，降低骨膠原蛋白的分解和抑制膠原蛋白酶的合成，有效促進骨細胞的有絲分裂和成骨細胞的功能分化，增強堿性磷酸酶活性和鈣鹽沉著［2］。同時，IGF1對軟骨細胞形態(tài)發(fā)生和有絲分裂以及功能代謝都有廣泛影響［3］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是目前應(yīng)用最多的一類促骨生長因子。其中BMP-2是公認的最主要的骨形成調(diào)控因子，其誘導(dǎo)成骨的生物學(xué)作用和長期效果也已被證實。近年研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2的表達受多種因子的調(diào)節(jié)，如王霖霞等［4，5］以不同濃度的IGF1刺激分離培養(yǎng)的大鼠成骨細胞，發(fā)現(xiàn)IGF1可在轉(zhuǎn)錄水平增加大鼠成骨細胞中BMP-2基因的表達，并呈明顯的劑量依賴關(guān)系，我們通過檢測兔激素性股骨頭壞死治療前后IGF1、BMP2 mRNA及蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)兩者表達呈明顯正相關(guān)，由此推測在骨修復(fù)過程中，IGF1對BMP2的表達可能具有正向調(diào)節(jié)的作用。

髓芯減壓術(shù)(core decompression)作為治療股骨頭缺血性壞死的一種方法已有三十余年的歷史。其通過降低骨內(nèi)高壓，排出壞死組織，刺激加壓孔周圍的血管形成，增強壞死骨的爬行替代，使壞死灶得以消除。但研究認為，Ⅰ期患者經(jīng)過隨芯減壓治療后，臨床效果好，Ⅱ期治療應(yīng)慎重，Ⅲ期治療效果不好［6］。髓芯減壓術(shù)只能緩解疼痛的癥狀，一旦發(fā)生股骨頭壞死，它的病理過程將持續(xù)發(fā)展，最終全髖置換術(shù)將不可避免。我們研究發(fā)現(xiàn)，髓芯減壓術(shù)后，IGF1和BMP-2的表達沒有發(fā)生改變。可見，單純髓芯減壓術(shù)并不能緩解激素對壞死骨組織自我修復(fù)的抑制作用，因此仍有一定的局限性，若能結(jié)合其他促進股骨頭隧道內(nèi)血管再生及骨形成的治療，必將加快股骨頭的修復(fù)，提高療效并擴大適應(yīng)證。中藥淫羊藿具有溫腎壯陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功能，廣泛應(yīng)用于腎虛所致的腰膝酸軟、筋骨衰弱失用等，其主要化學(xué)成分為黃酮類化合物、木脂素及生物堿，其中淫羊藿總黃酮主要參與骨代謝，具有促進體外成骨細胞增殖及分化成熟，抑制破骨細胞的活性，從而達到治療骨質(zhì)疏松的作用。王欣文等［7］通過X線攝片、骨密度測定、生物力學(xué)測試以及組織學(xué)切片證實，淫羊藿促進家兔骨折愈合效果明顯，與BMP-2的效果相當(dāng)。在治療激素性股骨頭壞死方面，研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可以降低血液流變學(xué)的各項指標、保證組織有效灌注、改善股骨頭的局部微循環(huán)［8］;降低血液內(nèi)三酰甘油和總膽固醇的水平，有效改善股骨頭內(nèi)環(huán)境，促進損傷修復(fù)［9］;有效抑制皮質(zhì)激素對OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的影響，使OPG/RANKL比值接近正常，阻止由于OPG/RANKL表達異常導(dǎo)致的破骨細胞異常活化［10］。我們研究發(fā)現(xiàn)，中藥組與模型組，綜合組與手術(shù)組相比，IGF1和BMP-2表達明顯升高，骨密度及抗壓力均有所增加，提示淫羊藿通過上調(diào)IGF1和BMP-2的表達而加快激素性股骨頭壞死的修復(fù)。

綜上，我們可知隨芯減壓術(shù)可以緩解疼痛，延緩骨壞死的進展，但不能很好地促進壞死骨組織的自我修復(fù)，而中藥淫羊藿可促進骨生長，加快修復(fù)。淫羊藿配合隨芯減壓術(shù)可以利弊互補，有效增加股骨頭骨密度，提高骨強度，阻止股骨頭變形，為臨床上治療激素性股骨頭壞死提供了一種較為有效的方法。

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