精子DNA碎片與輔助生殖結(jié)局關(guān)系的研究進(jìn)展

王志強(qiáng)，楊 杰(綜述)，倪亞莉，柴三明(審校)(甘肅省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，甘肅 蘭州 730050)

·綜述·

精子DNA碎片與輔助生殖結(jié)局關(guān)系的研究進(jìn)展

王志強(qiáng)，楊 杰(綜述)，倪亞莉，柴三明*(審校)
(甘肅省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，甘肅 蘭州 730050)

生殖技術(shù)，輔助；活性氧；精子DNA碎片

我國不孕癥患病率大約為10%～15%，而在眾多的不孕原因中，男方因素所致不孕可達(dá)40%。約10%正常男性以及20%～25%不育男性都有較嚴(yán)重的精子DNA損害[1]。精子DNA損傷可能會對精子的正常受精能力以及受精以后的胚胎發(fā)育過程產(chǎn)生影響，并通過人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)造成醫(yī)源性的傳播。對于男性不育患者，尤其是嚴(yán)重少弱精和非阻塞性無精癥患者，如何通過ART技術(shù)降低可能因精子DNA異常所致的不良妊娠事件和新生兒出生缺陷的發(fā)生率，改善妊娠結(jié)局，是生殖醫(yī)學(xué)發(fā)展亟待解決的難題。現(xiàn)就精子DNA碎片研究進(jìn)展及其與輔助生殖結(jié)局的關(guān)系綜述如下。

1 精子DNA碎片產(chǎn)生機(jī)制

精子是一種具有特殊形態(tài)的高度分化細(xì)胞，其特定的形態(tài)在一定程度上可以保護(hù)精子DNA免受外界毒物的損傷。精子DNA碎片的形成主要由其內(nèi)部因素所致，形成機(jī)制包括：①精子染色質(zhì)組裝缺陷、內(nèi)源性核酸酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ)異常；②凋亡異常；③氧化應(yīng)激是產(chǎn)生精子DNA碎片的主要原因，同時非整倍體也可以引發(fā)精子DNA碎片的產(chǎn)生，疾病、高熱、睪丸局部溫度增高、環(huán)境毒物、吸煙、藥物和年齡等原因也可能造成精子DNA 的損傷。

1.1 活性氧對精子DNA的損傷：精液中活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生過多或消除減少，都會導(dǎo)致精子ROS高于正常水平。形態(tài)或功能異常的精子、精液中白細(xì)胞的異常聚集、陰囊溫度過高、精索靜脈曲張、年齡增長以及吸煙等不良嗜好都可使精子ROS水平上升[2]。同時，當(dāng)機(jī)體自身的抗氧化能力出現(xiàn)異常而不能及時清除過多的ROS時，也會使精子ROS超過正常水平?；钚匝蹩蓞⑴c精子的超活化、精子獲能、頂體反應(yīng)以及其他一些生育相關(guān)的分子生物學(xué)過程。生理狀況下，精子內(nèi)部ROS始終維持在相對穩(wěn)定的水平，當(dāng)精子ROS水平超出了精子的抗氧化防御系統(tǒng)導(dǎo)致精子處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，不僅會影響精子的正常受精能力，同時還會對受精以后的胚胎發(fā)育過程產(chǎn)生影響。

精子內(nèi)部含有豐富的多元不飽和脂肪酸，精子DNA的損傷修復(fù)能力相對有限以及精子抗氧化能力相對較弱，這使得精子更容易受到高水平ROS的影響。ROS對精子的損傷作用主要是通過引起脂質(zhì)過氧化、損傷精漿蛋白和DNA來體現(xiàn)的；此外，精子線粒體作為產(chǎn)生ROS的細(xì)胞器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS達(dá)到一定水平之后，也會受到ROS的損傷，大量線粒體被破壞，由于能量的缺乏，可使精子活力明顯下降[3]。精子DNA完整性與妊娠過程密切相關(guān)，DNA發(fā)生氧化損傷的精子依然有能力與卵母細(xì)胞結(jié)合受精，但是損傷的DNA一旦整合到胚胎基因，它將可能導(dǎo)致發(fā)育過程中的胚胎DNA在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯時發(fā)生錯誤，從而引起各類不良妊娠結(jié)局[3-4]。

1.2 精子DNA碎片與蛋白組學(xué)改變：正常成年男性一次射出的精液包含多種細(xì)胞成分和不同發(fā)育階段的精子。含有大量精子DNA碎片的精液中，其精子蛋白組學(xué)可能會發(fā)生改變。①碎片基因的翻譯錯誤，因為精子蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程在精子形成之前一直處于十分活躍的狀態(tài)，錯誤的DNA信息可通過轉(zhuǎn)錄和翻譯過程傳遞給新合成的蛋白[5]。②在精子的儲存、成熟和運(yùn)輸過程中，附睪液與精子膜蛋白之間以主動轉(zhuǎn)運(yùn)為基礎(chǔ)的蛋白交換也可引起精子蛋白組學(xué)的改變。正常狀況下，附睪液和精子膜蛋白之間存在大量的蛋白交換，精子細(xì)胞膜通過不斷向內(nèi)主動轉(zhuǎn)運(yùn)附睪分泌蛋白的同時，也會移除特定的睪丸蛋白。魚精蛋白是含量最為豐富的精子核蛋白，但其具體的作用機(jī)制尚不明確，生殖醫(yī)學(xué)研究對其生理作用作出了3種可能的推測，即濃縮精子細(xì)胞核、保護(hù)父系基因免受核酸酶和自由基的損傷以及基因印記。帶正電荷的魚精蛋白可以通過與帶負(fù)電荷的精子DNA結(jié)合，形成緊密的DNA-魚精蛋白復(fù)合體，因此，當(dāng)精子蛋白組學(xué)發(fā)生改變致使魚精蛋白缺乏或形成的DNA-魚精蛋白復(fù)合體受損時，增加DNA碎片形成的可能性。

2 精子DNA碎片檢測方法

雖然精子DNA完整性的檢查目前尚未納入不孕癥臨床常規(guī)檢查，但其對輔助生殖治療的短期受精評估、胚胎發(fā)育、結(jié)局預(yù)測以及長期的子代健康影響都有十分重要的意義。彗星實驗(COMET assay)被認(rèn)為是目前現(xiàn)有的DNA碎片檢測方法中最敏感的，它可以檢測包括單鏈損傷、雙鏈損傷以及堿基位點(diǎn)的破壞等多種精子DNA異常[6]。通過彗星實驗檢測精子DNA碎片時，需要的精子細(xì)胞數(shù)較少，這使得彗星實驗更適合對嚴(yán)重少弱精患者精子DNA完整性進(jìn)行評估。研究[7]表明，相比單純的精子活力檢查，彗星實驗在ART中具有更高的診斷和預(yù)測價值。但是，要將彗星實驗應(yīng)用到常規(guī)的精子DNA實驗室檢查體系，還必須對其過程進(jìn)行最優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，測定其檢測的敏感度和特異度，評估測量的重復(fù)性。

除了彗星實驗，在精子DNA碎片檢測方面應(yīng)用較為廣泛的方法還有原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)、精子染色體結(jié)構(gòu)試驗(sperm chromatin structure assay,SCSA)以及精子染色體擴(kuò)散實驗(sperm chromatin dispersion,SCD)。其中，TUNEL實驗可以直接檢測精子DNA單鏈和雙鏈的損傷，且在檢測之前不需進(jìn)行精子DNA變性，操作簡單，是目前精子DNA碎片檢查的重要方法之一。SCSA法是通過流式細(xì)胞儀分析吖啶橙與單鏈或雙鏈DNA結(jié)合后產(chǎn)生的不同熒光而對精子DNA完整性進(jìn)行評估的一種方法，此法為定量檢測，敏感性高，操作方便，檢測時間短，能在幾秒鐘內(nèi)快速檢測5 000個精子細(xì)胞，且目前已有標(biāo)準(zhǔn)化的DNA斷裂程度衡量標(biāo)準(zhǔn)，在世界范圍內(nèi)得到普遍認(rèn)可，甚至被稱為精子DNA碎片檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。SCD法檢測精子DNA碎片時，對精子進(jìn)行特定處理后可直接在光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，且整個過程能夠保持精子尾部的完整。該法操作簡單，費(fèi)用低廉，組間和組內(nèi)變異較小，已被越來越多的機(jī)構(gòu)認(rèn)可。然而，任何一種檢測方法都有其本身的優(yōu)缺點(diǎn)，要想將其應(yīng)用到臨床進(jìn)行精子DNA完整性的常規(guī)檢查并對ART治療結(jié)局作出相對準(zhǔn)確的診斷和預(yù)測，尚需得到進(jìn)一步研究證實。

3 精子DNA碎片與ART結(jié)局的關(guān)系

研究[8]表明，不同程度少弱精和畸形精子癥患者精子DNA碎片明顯升高。通過TUNEL實驗和彗星實驗評估DNA碎片指數(shù)(DNA fragment index,DFI)，發(fā)現(xiàn)DNA碎片能夠明顯影響體外受精(in vitro fertilization,IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的助孕結(jié)局[9]，從精液常規(guī)分析和精子DNA碎片之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，精液常規(guī)分析顯示精液參數(shù)異常以及由遺傳或非遺傳因素所致的非梗阻性無精癥患者精子DFI顯著增高[10]。但是，精子DNA碎片是否能夠為ART臨床提供更準(zhǔn)確的預(yù)測信息，尚未得到一致的認(rèn)可。通過研究嚙齒類動物，發(fā)現(xiàn)含有DNA碎片的精子雖然能夠使卵母細(xì)胞受精并形成高質(zhì)量的胚胎，但與其后續(xù)的胚胎著床、胚胎發(fā)育、表觀遺傳改變、臟器肥大、神經(jīng)發(fā)育和行為異常以及肺和皮膚實體腫瘤的發(fā)生都有明顯的相關(guān)性[11]。有報道稱，精子DNA碎片對IVF受精率、卵裂率、種植率和妊娠率均沒有影響[12]，而在ICSI周期中，精子DFI可對種植率和妊娠率產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響[13]。許多ICSI出生的嬰兒發(fā)生生殖泌尿系統(tǒng)畸形被認(rèn)為可能與精子挑選失敗有關(guān)。盡管如此，由于缺乏更好的治療手段和儀器設(shè)備，在嚴(yán)重少弱精和畸形精子癥等被認(rèn)為含有較多精子DNA碎片的患者中，目前仍首選ICSI進(jìn)行授精。精子DNA碎片與ART受精率之間的關(guān)系也一直存在爭論。有研究[14]認(rèn)為，精子DNA碎片可對輔助生殖IVF和ICSI受精率產(chǎn)生明顯影響，導(dǎo)致男性生育能力低下甚至不育。而Benchaib 等[15]研究顯示，當(dāng)精子DNA碎片<10%時，無論采取IVF還是ICSI授精，都不會對受精率產(chǎn)生影響。有研究[16]認(rèn)為，精子DNA碎片對預(yù)測流產(chǎn)有一定的價值。但Brahem 等[17]的報道卻恰恰相反，他們認(rèn)為精子DNA碎片與流產(chǎn)之間沒有任何關(guān)系。在最近一項有關(guān)精子DNA碎片和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的前瞻性隊列研究中也沒有發(fā)現(xiàn)精子DNA碎片對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有任何預(yù)測價值，在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者夫婦中，男性精子DNA碎片指數(shù)與正常對照組之間沒有差異[18]。同樣，精子DNA碎片與卵裂期胚胎和囊胚發(fā)育之間的關(guān)系，目前仍沒有一致的結(jié)果[15,19]。

總之，精子DNA碎片對生殖過程的影響尚不能通過現(xiàn)有研究得出結(jié)論，但是精子DNA的完整性可能與整個生殖過程之間存在密切的關(guān)系，是生殖醫(yī)學(xué)和男科學(xué)發(fā)展中的重要課題。

4 降低精子DNA碎片的方法及對生育的影響

研究[20]認(rèn)為補(bǔ)充抗氧化維生素及其他抗氧化劑可以有效減少精子DNA碎片，采用維生素E和維生素C進(jìn)行抗氧化治療雖然能夠降低精子DNA碎片，但維生素C在發(fā)揮其抗氧化活性的同時，能夠通過打開蛋白質(zhì)二硫鍵干擾父方基因活性而使精子DNA發(fā)生去濃縮，影響精子功能。高達(dá)40%的不孕男性精子ROS維持在較高水平，但由于引起精子DNA產(chǎn)生損傷而形成DNA碎片的ROS閾濃度并不確定，這使得抗氧化劑的使用和患者的選擇尚未得出統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。有文獻(xiàn)[21]報道，對先天性少弱精患者經(jīng)過90d的重組卵泡刺激素(recombinant follicle stimulating hormone，rFSH)的治療后，其精子DNA碎片得到了明顯的改善，但接受維生素抗氧化治療組治療前后差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。而經(jīng)過rFSH治療好轉(zhuǎn)后是否能夠提高ART治療的臨床妊娠率目前并不清楚。吸煙被認(rèn)為與精子DNA碎片和不良精液參數(shù)有關(guān)，同時，吸煙與子代腫瘤的發(fā)生也有明顯相關(guān)[22]。有研究[23]作出推斷，精子DNA碎片可能對子代腫瘤的發(fā)生存在潛在的影響。因此，育齡期夫婦應(yīng)盡量戒除吸煙等不良嗜好，遠(yuǎn)離具有潛在生殖毒性的各種毒物和藥物，建立健康良好的行為生活方式。除了對患者進(jìn)行藥物干預(yù)和行為指導(dǎo)，在接受輔助生殖技術(shù)助孕時，精子的體外優(yōu)化處理十分重要。目前，精子的體外處理方法主要為上游法和密度梯度離心法，二者都可以很大程度對精子進(jìn)行優(yōu)化選擇。相比上游法，經(jīng)密度梯度離心法處理后的精子具有更高的DNA完整性[24]。密度梯度離心法由于長時、高速的離心以及經(jīng)受梯度試劑的影響，本身可增加精子DNA碎片。但密度梯度離心法對精子的損傷與輔助生殖的關(guān)系，除了部分研究認(rèn)為密度梯度離心法可能會影響后期的囊胚發(fā)育外[19]，并無證據(jù)提示其對精子的損傷可產(chǎn)生更多不良后果。

5 研究前景與挑戰(zhàn)

傳統(tǒng)的精液常規(guī)檢查從形態(tài)學(xué)角度出發(fā)，采用相差顯微鏡，評估精液的4種輔助參數(shù)，即精液體積、精子密度、活力以及精子形態(tài)。但是，這些形態(tài)學(xué)特征在男性生育能力和精子功能的評估方面具有很大的局限性。從以上有關(guān)最新研究推斷，精子DNA碎片檢查可能是一種具有預(yù)測價值的精子功能評估方法，精子DNA完整性也有很大潛力成為一種生物標(biāo)記物用來分析IVF過程中出現(xiàn)的胚胎分裂異常、高流產(chǎn)率及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等問題。然而，由于受當(dāng)前生殖醫(yī)學(xué)對精子DNA的認(rèn)識和檢測方法的限制，尚沒有標(biāo)準(zhǔn)化的精子DNA碎片檢測體系和精子DFI對生育能力的預(yù)測模型。同時，精子DNA完整性對輔助生殖技術(shù)中配子的受精、發(fā)育、種植以及臨床妊娠率和流產(chǎn)率的影響未能在學(xué)界達(dá)成共識，暫時只能將其作為男性生育能力評估的參考方法。因此，標(biāo)準(zhǔn)化男性精子DNA實驗室檢測技術(shù)，尋找有效的精子DNA損傷臨床治療方法，開發(fā)相對準(zhǔn)確的ICSI精子選擇手段以及高特異無侵入性的精子功能評估方法對于現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)的發(fā)展具有十分重要的意義。

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(本文編輯：許卓文)

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《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》編輯部

2014-04-02；

2014-04-21

甘肅省青年科技基金計劃項目(1107RJYA062)

王志強(qiáng)(1986-)，男，甘肅定西人，甘肅省婦幼保健院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事人類輔助生殖技術(shù)研究。

R711.6；R21.33

A

1007-3205(2014)12-1485-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.12.045

*通訊作者。E- mail:chaisanming@163.com