車軸草屬植物異黃酮分析和比較研究

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(長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，藥物材料合成設(shè)計實驗室，長春 130117)

車軸草屬植物異黃酮分析和比較研究

胡冬華，閆娜，何振洋，許士杰，鐘婷，趙珊珊，和東亮*

(長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，藥物材料合成設(shè)計實驗室，長春 130117)

目的 形成吉林省紅、白車軸草異黃酮成分提取、分離、純化方法，進(jìn)行車軸草屬植物異黃酮有效成分對比分析和研究。方法 用乙醇提取車軸草屬植物異黃酮有效成分，采用溶劑純化法精制異黃酮，采用紫外分光光度法進(jìn)行總異黃酮含量測定及提取工藝優(yōu)化研究。結(jié)果 車軸草屬植物含有刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素、染料木素及大豆苷元等，其中刺芒柄花素在車軸草屬植物各部位含量豐富均衡，色譜分析結(jié)果穩(wěn)定，可作為吉林省野生車軸草異黃酮成分分析標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)論 吉林省野生紅車軸草藥用植物中所含異黃酮種類豐富，白車軸草中含有染料木素、刺芒柄花素等異黃酮成分，研究結(jié)果有望為我省長白山地區(qū)野生車軸草藥用植物資源開發(fā)利用提供指導(dǎo)。

紅車軸草；白車軸草；異黃酮；葛根；比較研究

車軸草屬植物所含的植物異黃酮有植物黃金之美譽(yù)，在預(yù)防和治療更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥、心腦血管疾病、抗癌等病中發(fā)揮功效，因此極具藥品和保健品研發(fā)價值[1-5]。本研究擬對紅車軸草與白車軸草異黃酮成分進(jìn)行對比分析，優(yōu)選和建立適宜的異黃酮純化方法。采用色譜分析法，光譜法研究紅、白車軸草異黃酮成分，優(yōu)化相關(guān)工藝，確定最佳參數(shù)，為進(jìn)一步開發(fā)白車軸草，擴(kuò)大含有異黃酮的藥用植物資源范圍，提供實驗支持和參考[6-9]。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料 紅車軸草和白車軸草樣品2013年6月采自吉林省長春市凈月經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)野外，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)教研室張景龍教授鑒定后，曬干、粉碎、過40目篩備用。

1.2 實驗試劑 刺芒柄花素、染料木素、鷹嘴豆芽素、大豆苷元對照品，購自中國藥品生物制品檢定所,甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯化鋁均為分析純,購自北京化工廠。

1.3 實驗方法 準(zhǔn)確稱取一定量的已烘干、粉碎，40目過篩的車軸草置于圓底燒瓶中，采用乙醇水溶液加熱回流提取和超聲法提取。實驗在預(yù)先設(shè)定的提取次數(shù)、提取溫度、料液比以及提取時間下進(jìn)行，待提取完成后，趁熱過濾，然后將提取液減壓真空濃縮，回收溶劑。將濃縮液干燥，得到車軸草總異黃酮浸膏。

1.3.1 提取工藝 探索并篩選出紅車軸草中總異黃酮的提取最佳工藝。首先,通過單因素實驗考察了總異黃酮的提取效果，然后，采用正交實驗法進(jìn)行優(yōu)化，最終得到提取最佳工藝參數(shù)。

1.3.2 脫脂工藝 采用石油醚進(jìn)行熱回流脫脂實驗,分別考察了脫脂次數(shù)、脫脂溫度、脫脂時間以及料液比對紅車軸草總異黃酮浸膏脫脂效果的影響，并通過正交實驗進(jìn)行優(yōu)化，篩選出石油醚脫脂最佳工藝參數(shù)。

1.3.3 純化工藝 根據(jù)黃酮類化合物自身的性質(zhì)，采用J堿溶酸沉法及醇溶水沉法對紅車軸草中總異黃酮進(jìn)行了純化工藝的研究，分別考察堿溶pH、酸沉pH、水沉加水量對異黃酮含量及浸膏得率的影響，得到最佳純化工藝。

2 結(jié)果

2.1 回流提取法和超聲法對比研究 考察了乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比等因素，結(jié)果表明采用熱回流提取法從紅車軸草和白車軸草提取異黃酮的最佳工藝條件是：乙醇濃度75%，提取溫度80 ℃，乙醇用量10倍(V/W),浸提時間1.5 h。采用超聲提取法，超聲功率為250 W。超聲法設(shè)備簡單，操作方便，時間短，效率高,無需加熱，節(jié)省溶劑。

2.2 紅、白車軸草異黃酮的對比研究

2.2.1 紅車軸草異黃酮的提取 將紅車軸草藥材曬干，粉碎。取紅車軸草粗粉14.27 g,加入62.00 mL甲醇溶液，超聲提取30 min，2次。合并2次的提取液，過濾，除去藥渣，在50 ℃將濾液干燥。干燥后稱量得浸膏2.35 g。

2.2.2 白車軸草異黃酮的提取 將白車軸草藥材曬干，粉碎。取白車軸草粗粉14.33 g,加入64.49 mL甲醇溶液，超聲提取30 min，2次，合并2次的提取液，過濾，除去藥渣，在50 ℃將濾液干燥。干燥后稱量得浸膏2.08 g。

2.2.3 異黃酮的分離純化 1)紅車軸草異黃酮的分離純化。將紅車軸草浸膏用20 mL蒸餾水分散，每次加15 mL石油醚進(jìn)行萃取脫脂共3次，取下層液體，置于干燥箱中干燥得浸膏1.07 g。用100 mL蒸餾水將浸膏溶解，用2 moL/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=8.5，并過濾得淺綠色濾液。再用2 moL/L的的硫酸調(diào)節(jié)pH=2.5，離心得沉淀。固體干燥后加適量乙醇溶解，加6倍量的蒸餾水離心得精制的針狀異黃酮結(jié)晶，干燥后稱重0.36 g。2)白車軸草異黃酮的分離純化。將白車軸草浸膏用20 mL蒸餾水分散，每次加15 mL石油醚進(jìn)行萃取脫脂共3次，取下層液體，置于干燥箱中干燥得浸膏0.73 g。分別用100 mL蒸餾水將浸膏溶解，用2 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=8.5，并過濾得淺綠色濾液。再用2 moL/L的硫酸調(diào)pH=2.5,離心得沉淀。固體干燥后加適量乙醇溶解,加6倍量的蒸餾水離心得精制的針狀異黃酮結(jié)晶，干燥后稱重0.24 g。

2.2.4 異黃酮成分的檢測 1)供試品溶液制備。分別取紅車軸草和白車軸草乙醇提取物樣品5 mg，加5 mL乙醇超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)10 min使溶解作為供試品溶液。2)對照溶液的制備。取刺芒柄花素對照品、染料木素對照品、鷹嘴豆芽素對照品、大豆苷元對照品各5 mg，分別加5 mL甲醇超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)10 min使溶解，作為對照品溶液。3)薄層色譜條件 分別選用甲酸-水-乙醇(0.2∶1∶4)，甲酸-水-乙醇(0.1∶1∶5)，甲酸-水-乙醇(0.1∶1∶4)為展開劑,展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁溶液(取三氯化鋁0.1 g，加乙醇溶液10 mL使溶解，即得)，晾干，置紫外光燈(254，365 nm)下檢視。

驗證結(jié)果以甲酸-水-乙醇(0.2∶1∶4)為展開劑,展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁溶液(取三氯化鋁0.1 g，加乙醇溶液10 mL使溶解，即得),100 ℃加熱晾干置紫外燈下檢視，此薄層色譜條件效果較好。

紅車軸草供試品色譜中，在與鷹嘴豆芽素、刺芒柄花素、染料木素對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。經(jīng)反復(fù)試驗表明紅車軸草中含有鷹嘴豆芽素，染料木素，刺芒柄花素，大豆苷元。

白車軸草供試品色譜中，在刺芒柄花素、染料木素對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，表明白車軸草中含有刺芒柄花素、染料木素。

通過紅車軸草與白車軸草中總提取物與大豆苷元對照品、刺芒柄花素對照品、染料木素對照品、鷹嘴豆芽素對照品的薄層色譜檢識可以發(fā)現(xiàn)，吉林省野生紅車軸草和白車軸草含有相同的異黃酮成分包括豐富的刺芒柄花素和染料木素。

2.2.5 石油醚脫脂工藝 石油醚脫脂實驗所篩選的石油醚脫脂工藝條件重現(xiàn)性良好,確定紅車軸草總異黃酮浸膏脫脂最佳工藝參數(shù)為：脫脂溫度50 ℃，料液比1∶7，脫脂時間0.5 h，脫脂次數(shù)3次。在此條件下，異黃酮脫脂效果較好，所得浸膏中總異黃酮含量平均為15.66%。

2.2.6 堿溶酸沉純化異黃酮 經(jīng)石油醚熱回流脫脂后，紅、白車軸草總異黃酮的含量提高，且所得浸膏易干燥，顏色呈黃綠色，易儲存。堿溶最佳條件堿溶pH為8.5，酸沉最佳pH為2.5。

3 結(jié)論

本工作考察紅、白車軸草異黃酮成分提取分離關(guān)鍵技術(shù)，以及化學(xué)溶劑精制法精制異黃酮的最佳工藝。研究表明紅白車軸草均含有豐富典型的刺芒柄花素成分。解釋和證明了采用刺芒柄花素作為標(biāo)準(zhǔn)品研究車軸草屬植物中的異黃酮成分是合理可行的，可降低測試成本。

以提取的紅白車軸草總異黃酮為原料，采用石油醚進(jìn)行熱回流脫脂，分別考察了提取次數(shù)、提取溫度、提取時間、料液比對紅車軸草總異黃酮浸膏脫脂效果的影響，篩選出石油醚脫脂最佳工藝參數(shù)。其最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度75%，料液比為1∶8，脫脂溫度為80 ℃，脫脂時間為1.5 h。

采用堿溶酸沉法及醇溶水沉法對車軸草屬植物中總異黃酮進(jìn)行了進(jìn)一步純化，分別考察堿溶pH、酸沉pH、水沉加水量對異黃酮含量及浸膏得率的影響，得到最佳純化工藝。該工藝為堿溶最佳pH為8.5，酸沉pH為2.5，加水量6倍量。

本研究首次對吉林省蛟河地區(qū)野生紅車軸草及其同屬植物白車軸草的異黃酮成分進(jìn)行對比分析，為拓展含有異黃酮成分的藥用植物資源提供實驗依據(jù)，為異黃酮相關(guān)車軸草屬藥用植物開發(fā)提供依據(jù)，為車軸草屬植物防治乳腺癌及更年期癥狀等雌激素相關(guān)領(lǐng)域疾病研究工作提供參考。

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Analysisandcomparisonofisoflavonesintrifoliumplants

HU Donghua,YAN Na,HE Zhenyang,ZHONG Ting,ZHAO Shanshan,HE Dongliang*

(Medicinal Materials Synthesis & Design Lab,College of Medicine,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117)

ObjectiveTo form ingredient extraction,separation and purification methods of Jilin province’s isoflavones contained in Trifolium plants,process the study of analysis and comparison the effective element of Trifolium pratense and Trifolium repens isoflavones.MethodsWith ethanol extraction plants of the Trifolium isoflavones active ingredients,using solvent purification method of refined isoflavones,and Using ultraviolet spectrophotometry for determination of total isoflavones content and extraction process optimization research.ResultsTrifolium plants contains mans handle,flowers,olecranon bean sprouts element A,genistein and daidzein yuan,etc.,including sting mans handle,the rich content in each part of the plants of the genus clover equilibrium,chromatographic analysis result is stable and can be used as A wild clover isoflavones composition analysis of jilin province standard.ConclusionTrifolium pratense herb of jilin province with rich plant contains isoflavones,the Trifolium repens contains genistein,mans handle,the composition of isoflavones,the results of the study is expected to the changbai mountain area of sichuan province guide axle wild herbs with the development and utilization of plant resources.

trifolium pratense;trifolium repens;isoflavones;puerariae;comparison

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.023

吉林省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技項目(YJS-0207)；吉林省衛(wèi)生廳科研項目(20112067)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(20131099046)。

胡冬華(1977-)，女，博士，副教授。研究方向：藥物有效成分分析與合成設(shè)計研究。

] 和東亮，男，博士，講師，電話：13604438860，電子信箱：hudonghua8888@126.com。

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：2095-6258(2014)05-0822-03

2014-05-03)

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