不同產(chǎn)地野生豬苓多糖與麥角甾醇的含量分析

李香串，梁文儀

(1.山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006；2.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024)

豬苓為多孔菌科真菌豬苓[Polyporusumbellatus(Pers.)Fries]的干燥菌核，主產(chǎn)于陜西、云南、河南、山西等省，其性平，味甘、淡，具有利水滲濕之功效[1]，中醫(yī)臨床上主要用于治療急性腎炎、淋病、糖尿病、全身浮腫、小便不暢、急性胃炎、泄瀉、淋濁、帶下[2-3]等。已報(bào)道的豬苓化學(xué)成分主要有多糖類、甾體類、非甾體類(除多糖類外)、氨基酸類、維生素類及微量元素等，其中豬苓多糖具有增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、保肝、抗老防衰、抗輻射、抗誘變等作用[4-5]；麥角甾醇具有一定的利尿作用，生物代謝研究發(fā)現(xiàn)麥角甾醇和麥角甾醇的過(guò)氧化物可以通過(guò)一系列的生物合成途徑合成麥角甾酮，麥角甾醇的利尿作用可能是麥角甾醇在體內(nèi)二氧化酶作用下轉(zhuǎn)化為麥角甾酮[6]。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)報(bào)道[10-13]采用紫外-可見(jiàn)分光光度法及高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地豬苓中豬苓多糖及麥角甾醇的含量，比較不同產(chǎn)地、不同來(lái)源豬苓藥材的質(zhì)量差異，為豬苓的優(yōu)種選育及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1601紫外可見(jiàn)分光光度儀(北京瑞利分析儀器公司)；METTLER TOLEDO EL204 型萬(wàn)分之一電子天平；METTLER TOLEDO AB135-S 型十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KQ200E 型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-2水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；DL-5C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HC-500A型粉碎機(jī)(浙江省安康市金穗機(jī)械制造廠)；DIONEX Summit HPLC色譜儀(P680 HPLC Pump，UVD 170U檢測(cè)器，Chromeleon工作站)等。

1.2 試藥

D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201205)；麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111845-201102)；無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚、甲醇等均為分析純；甲醇(OCEANPAK，瑞典)為色譜純。

豬苓藥材部分采集于山西、陜西等地，部分購(gòu)于太原市內(nèi)各藥店(見(jiàn)表1)，經(jīng)鑒定均為多孔菌科真菌豬苓[Polyporusumbellatus(Pers.)Fries]的干燥菌核或子實(shí)體,粉碎過(guò)40 目篩，混合均勻后備用。

表1 豬苓樣品來(lái)源

圖1 豬苓樣品圖

2 方法與結(jié)果

2.1 豬苓多糖的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取D-無(wú)水葡萄糖適量，精密稱定，加蒸餾水制成每1 mL含0.055 5 mg的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

取豬苓粉末約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，如上重復(fù)提取1 次，合并濾液，濃縮至適量，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取25 mL，加無(wú)水乙醇100 mL，搖勻，冷藏靜置24 h，離心，取沉淀加水溶解，置50 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.925 0 mg·mL-1)0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL，1.4 mL，分別置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取上述各對(duì)照品溶液1 mL，分別加5 %苯酚溶液2.5 mL，混勻，加入濃硫酸10 mL，搖勻，放冷后，沸水浴15 min冷卻。以試劑為空白，在489 nm波長(zhǎng)處采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)吸光度值。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)(y)，對(duì)照品溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)(x)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.065 6x+0.047 3，r=0.999 0，結(jié)果表明葡萄糖含量在0.018 5 mg·mL-1～0.129 5 mg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于樣品中豬苓多糖的含量計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 豬苓多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.4 精密度試驗(yàn)

精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液(0.055 5 mg·mL-1)1.0 mL，照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下操作，顯色測(cè)定吸光度，重復(fù)6 次，以A值計(jì)算，RSD值為1.59%，結(jié)果符合要求。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取10 號(hào)豬苓樣品粉末6 份，精密稱定，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下操作，顯色測(cè)定吸光度，計(jì)算豬苓多糖的含量，其RSD為2.54%，表明重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取10 號(hào)豬苓樣品粉末1 份，精密稱定，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下操作，顯色后，于 0 min，30 min，60 min，90 min，120 min連續(xù)測(cè)定，以A值計(jì)算，RSD值為1.82 %，表明2 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.7 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的10號(hào)樣品約0.5 g共6份，每份分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品3.549 0 mg，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，得各加樣回收供試品溶液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下操作，完成顯色后測(cè)定豬苓多糖含量，計(jì)算豬苓多糖回收率為99.50%，RSD為2.23%。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.8 樣品的含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，得供試品溶液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下操作，顯色后測(cè)定豬苓多糖含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同產(chǎn)地豬苓樣品中豬苓多糖含量的測(cè)定結(jié)果

2.2 麥角甾醇的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm；流速1.0 m·min-1；柱溫 30 ℃。在此色譜條件下對(duì)照品和豬苓樣品的HPLC色譜圖分別見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 麥角甾醇對(duì)照品HPLC色譜圖

圖4 豬苓樣品HPLC色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取麥角甾醇對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.135 6 mg的麥角甾醇對(duì)照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備

取豬苓樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，稱定重量，密塞，超聲處理(功率220 W，頻率40 kHz)1 h，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足重量后，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取麥角甾醇對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.026 0 mg·mL-1)0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.8 mL，1.2 mL，1.6 mL，2.0 mL，分別置2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。精密吸取上述對(duì)照品溶液20 μL，按上述色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量(mg)為橫坐標(biāo)(x)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)(y)，得麥角甾醇線性回歸方程為：y=1 5472x+0.710 2，r=0.999 3，結(jié)果表明麥角甾醇進(jìn)樣量在0.000 226 0 mg～0.004 520 mg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于樣品中麥角甾醇的含量計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖5。

圖5 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取質(zhì)量濃度為0.135 6 mg·mL-1麥角甾醇對(duì)照品溶液20 μL，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得麥角甾醇色譜峰面積的RSD為1.41%，結(jié)果符合要求。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱定9號(hào)豬苓樣品粉末約0.5 g，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，平行制備6 份，得供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品含量。測(cè)得麥角甾醇色譜峰面積的RSD為1.63%，說(shuō)明該方法的有良好的重復(fù)性。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱定9 號(hào)豬苓樣品粉末約0.5 g，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，得供試品溶液，在上述色譜條件下，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h進(jìn)樣，測(cè)得麥角甾醇含量的RSD為1.90 %，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的9 號(hào)樣品約0.25 g共6 份，1～3號(hào)加入麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品各0.376 1 mg，4～6號(hào)加入麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品各0.406 8 mg，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，計(jì)算麥角甾醇平均回收率為97.01 %,，RSD為2.30 %。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 樣品的含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，得供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，根據(jù)峰面積值以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算豬苓藥材中麥角甾醇的含量，結(jié)果見(jiàn)表11。

表11 豬苓樣品中麥角甾醇含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 豬苓多糖含量測(cè)定的結(jié)果表明：不同產(chǎn)地和來(lái)源的樣品中豬苓多糖含量存在一定差異。同一產(chǎn)地野生豬苓子實(shí)體中多糖的含量遠(yuǎn)高于野生菌核中的含量，其中山西盂縣產(chǎn)豬苓子實(shí)體多糖含量最高，為60.694 6 mg·g-1，是菌核含量(2.151 7 mg·g-1)的28.2 倍，山西沁源產(chǎn)豬苓子實(shí)體多糖含量次高，為18.160 0 mg·g-1，是菌核含量(8.520 4 mg·g-1)的2.13倍，山西盂縣子實(shí)體豬苓多糖的含量為山西沁源的3.3 倍；菌核中豬苓多糖的含量范圍為2.151 7 mg·g-1～8.887 2 mg·g-1，以陜西留壩最高，山西沁源次之，山西盂縣最低。以豬苓多糖為選種質(zhì)量指標(biāo)，分離菌種首選山西盂縣豬苓花。

3.2 10個(gè)來(lái)源的豬苓樣品中麥角甾醇的含量之間存在一定的差異，且子實(shí)體中的含量遠(yuǎn)高于菌核中的含量，根據(jù)《中國(guó)藥典》2010版的規(guī)定，按干燥品計(jì)算麥角甾醇含量不得少于0.070%[2]，上述所有樣品均符合規(guī)定；其中山西沁源產(chǎn)豬苓子實(shí)體麥角甾醇含量最高，為4.187 0 mg·g-1，是菌核含量(2.023 2 mg·g-1)的2.1 倍；山西盂縣產(chǎn)豬苓子實(shí)體麥角甾醇含量次高，為3.551 1 mg·g-1，是菌核含量(0.825 9 mg·g-1)的4.3倍；菌核中麥角甾醇的含量范圍為0.825 9 mg·g-1～2.023 2 mg·g-1，山西沁源樣品最高，山西盂縣樣品最低。本研究范圍內(nèi)山西沁源產(chǎn)豬苓藥材品質(zhì)較好；以麥角甾醇為選種質(zhì)量指標(biāo)，分離菌種以山西沁源的豬苓花和菌核為最好。

3.3 同一產(chǎn)地豬苓子實(shí)體中多糖和麥角甾醇的含量遠(yuǎn)高于菌核中的含量，而菌核是法定的藥用部位，鑒于豬苓野生資源匱乏，進(jìn)一步研究子實(shí)體的藥用價(jià)值，為擴(kuò)大豬苓有效利用部位和來(lái)源提供科學(xué)依據(jù)。

3.4 豬苓多糖作為豬苓的有效成分之一，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，對(duì)慢性肝炎、腫瘤病有一定療效，《中國(guó)藥典》2010版卻未規(guī)定豬苓多糖的含量限度，因此，僅采用麥角甾醇評(píng)價(jià)豬苓是不全面和不系統(tǒng)的。為了更全面地衡量藥材質(zhì)量，可進(jìn)一步研究豬苓多糖與麥角甾醇在豬苓利水滲濕功效上的相互作用，從而揭示這兩種有效成分之間的關(guān)系。

3.5 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得不同來(lái)源豬苓中多糖與麥角甾醇的含量之間沒(méi)有必然的關(guān)系，因此對(duì)于多糖含量高而麥角甾醇含量很低的豬苓藥材(如3號(hào)產(chǎn)地豬苓藥材)可作為提取豬苓多糖的原料使用, 由此可使豬苓資源合理應(yīng)用。

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