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    血熱證銀屑病患者外周血Th1、Th2和Th17的表達(dá)

    2014-03-29 02:41:40曹筱筱李福倫王一飛
    關(guān)鍵詞:血熱證免疫吸附銀屑病

    曹筱筱 徐 蓉 李福倫 王一飛 范 斌 李 峰 李 斌 陳 潔

    血熱證銀屑病患者外周血Th1、Th2和Th17的表達(dá)

    曹筱筱 徐 蓉 李福倫 王一飛 范 斌 李 峰 李 斌 陳 潔?

    目的: 確定血熱證銀屑病患者Th1/Th2/Th17主要細(xì)胞因子與銀屑病血熱證候的相關(guān)性。方法: 分別采用流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PMBCs)及血漿Th1/Th2/Th17細(xì)胞分泌主要細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果: 血熱證銀屑病的CD4+I(xiàn)FN-γ為26.06±11.86較正常對(duì)照12.35±6.52升高(P<0.05);CD4+I(xiàn)L-4+及CD4+I(xiàn)L-17+較正常對(duì)照稍降低(P>0.05)。IFN-γ為91.20±48.37較正常對(duì)照47.44±21.46升高,而IL-4較正常對(duì)照下降(P<0.05)。IL-17的水平兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論: 血熱證銀屑病Th細(xì)胞免疫機(jī)制節(jié)點(diǎn)起主導(dǎo)作用的細(xì)胞亞型及細(xì)胞因子可能為Th1型,主導(dǎo)細(xì)胞因子為IFN-γ。

    銀屑?。?血熱證; Th細(xì)胞

    銀屑病是一種以皮膚的紅斑鱗屑為主要臨床表現(xiàn)的常見(jiàn)慢性復(fù)發(fā)性疾病,病理表現(xiàn)為炎癥性表皮過(guò)度增生,發(fā)病率高。1銀屑病中醫(yī)稱之為“白疕”,認(rèn)為本病病位在血分,急性期多以血熱為主,壅于肌表而發(fā),兼風(fēng)、寒、濕等因素;靜止期以血瘀為主,緩解期則以血虛為主。根據(jù)臨床表現(xiàn)將其分為“血熱證、血瘀證、血虛證”三個(gè)證候,在疾病發(fā)展的過(guò)程中,各個(gè)證候可以相兼且有所側(cè)重,直至相互轉(zhuǎn)化。本課題分別檢測(cè)尋常型銀屑病血熱型患者Th細(xì)胞的3種細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17,且與正常對(duì)照組進(jìn)行比較。以明確尋常型銀屑病(PV)血熱型患者起主導(dǎo)作用的Th細(xì)胞類型及其細(xì)胞因子,繼而篩選PV血熱證侯分型的標(biāo)志性細(xì)胞因子。

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象 2011年7月至2012年4月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科門診及病房有完整記錄的血熱證銀屑病患者30例,男19例,女11例;年齡20~65歲,平均46.36±13.04歲;其病情嚴(yán)重程度PASI評(píng)分為1.20~23.20分,平均10.35± 5.84分。正常對(duì)照為健康體檢者30名,其中男17名,女13名,年齡20~39歲,平均27.31±1.398歲。

    西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)2銀屑病進(jìn)行期:皮膚損害以紅色炎性丘疹、斑丘疹及大小不等的斑片為主,上覆多層銀白色鱗屑,刮除鱗屑可見(jiàn)一層光亮的薄膜,薄膜下有點(diǎn)狀出血(Auspitz征)。發(fā)病急,新疹多且不斷有新發(fā)疹出現(xiàn),可見(jiàn)同形反應(yīng)(Koebner現(xiàn)象)。

    中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)3血熱證:新皮疹不斷出現(xiàn),以丘疹、斑丘疹為主,疹基底皮膚顏色鮮紅,刮去鱗屑見(jiàn)點(diǎn)狀出血,可有同形反應(yīng)。初發(fā)或復(fù)發(fā),可有不同程度的瘙癢,心煩口渴或口干,便秘尿黃,舌質(zhì)紅,苔黃,脈數(shù)。

    納入標(biāo)準(zhǔn):明確診斷為尋常型銀屑病血熱證;年齡18~65歲;病程0~20年;所選病例均為新發(fā)或最近3月未作任何治療,且無(wú)其他疾病史者。排除標(biāo)準(zhǔn):3個(gè)月內(nèi)曾采用系統(tǒng)治療,包括大面積外用強(qiáng)效糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑;合并有心、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病,精神病患者。

    1.2 試劑和儀器 流式細(xì)胞儀檢測(cè)使用試劑及儀器:RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、淋巴細(xì)胞分離液均由PA公司提供;佛波酯(PMA)、離子霉素(ionomycin)購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司;莫能霉素(monensin)、T細(xì)胞表面抗體:抗人CD4 PE、細(xì)胞因子抗體,抗人IFN-γ、FITC及抗人IL-4 PE-Cy7均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司;流式細(xì)胞儀(MACSQuant SN2187)由德國(guó)Miltenyi公司生產(chǎn)。

    酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法使用試劑及儀器:抗人IFN-γ、IL-4、IL-17A;ELISA試劑盒由西塘科技生物有限公司提供;酶標(biāo)儀(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3)及洗板機(jī)(Wellwash 4 MK2)由芬蘭Thermo公司生產(chǎn);具體步驟:參見(jiàn)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)。

    1.3 方法 抽取患者及正常人外周靜脈血5 mL(肝素抗凝);1000 r/min離心×5 min后取血漿-80℃冰箱凍存?zhèn)錅y(cè)ELISA部分實(shí)驗(yàn);采用密度梯度離心法分離單一核細(xì)胞(PBMCs);取分離出PBMCs,5000 r/ min離心×5 min;去上清后再加磷酸緩沖液(PBS),再次5000 r/min離心×5 min;吸棄上清,加250μL PBS重懸,200μL/孔PBMC細(xì)胞懸液鋪入96孔板加試劑(PMA 100 ng/m L,離子霉素1μg/mL,莫能霉素2 μmol/L),刺激6 h后收細(xì)胞;300μL PBS,2000 r/min振蕩離心×5min;去上清后加50μL PBS,再加5μL CD4,孵育10 min后;加300μL PBS,2000 r/min振蕩離心×5 min;去上清加胞內(nèi)固定液500μL;30 min后再加500μL胞內(nèi)穿膜液離心2000 r/min×5 min;去上清加70μL胞內(nèi)穿膜液,分別加抗體IFN-γ、IL-4和IL-17A后振蕩過(guò)夜;加500μL胞內(nèi)穿膜液振蕩離心2000 r/min×5 min;去上清加300μL胞內(nèi)穿膜液上機(jī)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以ˉx±s表示,符合正態(tài)分布,則用t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    見(jiàn)表1、2。從表可以看出血熱證銀屑病患者的CD4+I(xiàn)FN-γ+較正常對(duì)照升高(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD4+I(xiàn)L-4+及CD4+I(xiàn)L-17+較正常對(duì)照降低(P>0.05),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿中IFN-γ較正常組有明顯升高(P<0.05),而血漿中IL-4較正常組下降(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿中IL-17較正常略有上升(P>0.05),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

    表2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法結(jié)果

    3 討論

    銀屑病病因病機(jī)比較復(fù)雜,幾千年以來(lái)中醫(yī)各家對(duì)銀屑病的辨證論治觀點(diǎn)各異,大部分的學(xué)者主張銀屑病從血分辨證為主,治療上也都從血入手,趙炳南4辨證分為3型:血熱證,血燥證,血瘀證。

    現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,5尋常型銀屑病的發(fā)病機(jī)制與異常T細(xì)胞導(dǎo)致表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增生有關(guān)。銀屑病的Th細(xì)胞主要向Th1及Th17方向分化,Treg起到微調(diào)上述分化的作用,而Th2則具有抑制上述分化趨向。6,7其中IFN-γ及IL-12促使Th向Th1分化并分泌IFN-γ、TNF-α等因子,Tbet是其關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子;IL-4誘導(dǎo)Th向Th2分化進(jìn)而分泌IL-4、IL-5等因子,GATA3是其關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子;IL-6、IL-23及TGF-β促使Th向Th17分化并分泌IL-6、IL-17及IL-22,RORγt是其關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。8

    通過(guò)本次研究可以發(fā)現(xiàn),血熱證銀屑病患者血漿IFN-γ與外周血PBMCs中CD4+I(xiàn)FN-ν+均較正常組有明顯升高,兩者結(jié)果一致,表明血熱證銀屑病患者以Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)主導(dǎo)地位。而血熱證銀屑病患者外周血PBMCs中CD4+I(xiàn)L-4+、CD4+I(xiàn)L-17+與血漿IL-4、IL-17的改變與正常對(duì)照均無(wú)明顯差異。上述結(jié)果提示Th2及Th17細(xì)胞在血熱證銀屑病中不具有特殊的意義。

    本課題通過(guò)兩種方法來(lái)檢測(cè)血熱證銀屑病患者3種Th細(xì)胞的代表性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17,兩者的結(jié)果基本一致。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法其特異性不如流式細(xì)胞技術(shù)高,檢測(cè)的IFN-γ、IL-4、IL-17不僅僅由Th細(xì)胞分泌,其他細(xì)胞也會(huì)少量的分泌,但是通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的結(jié)果可以對(duì)血熱證銀屑病做一個(gè)大致的判斷。

    本研究檢測(cè)的三類Th細(xì)胞及其細(xì)胞因子只是針對(duì)于血熱證銀屑病患者,其與正常對(duì)照比較,初步發(fā)現(xiàn)了此類型的患者Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子的表達(dá)較其他Th細(xì)胞比較占明顯的主導(dǎo)地位。但是對(duì)于血熱證銀屑病患者與其他證型的銀屑病患者在此三類Th細(xì)胞及其細(xì)胞因子之間是否有差異,有待于進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

    1Blauvelt A,Bichenbach JR,Dulesz-Martin MF,et al.Montagna symposium 2008:the biologic basis of posriasis.J Invest Dermatol,2009,129(2):259-260.

    2趙辨.臨床皮膚病學(xué).3版.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2001. 759-772.

    3上海市衛(wèi)生局.上海市中醫(yī)病癥診療常規(guī).2版.上海:上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社,2005.231-234.

    4趙炳南,張志禮.簡(jiǎn)明中醫(yī)皮膚病學(xué).北京:中國(guó)展望出版社,1983.9:200-203.

    5Oritz A,Yamauchi PS.A treatment strategy for psoriasis transitioning from systemic therapy to biologic agents.Skinmed,2006,5(6):285-288.

    6Harrington LE,Hatton RD,Mangan PR,et al.Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages.Nat Immunol,2005,6 (11):1123-1132.

    7 Park H,Li Z,Yang XO,et al.A distinct lineage of CD4 cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.Nat Immunol,2005,6(11):1133-1141.

    8Weaver CT,Harrington LE,Mangan PR,et al.Th17:an effector CD4T cell lineage with regulatory T cell ties.Immunity,2006,24:277-688.

    (收稿:2013-10-30)

    The expression of Th1/Th2/Th17 in peripheralblood of the patientsw ith b lood-h(huán)eat syndrome of psoriasis

    CAO Xiao-xiao,XU Rong,LIFu-lun,et al.Yueyang Hospital of Integrative Chinese&Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,200437

    Objective:To determ ine the association between Th1/Th2/Th17 cytokines,and blood-h(huán)eat syndrome of psoriasis.Methods:Flow cytometry and ELISA were applied to test Th1/Th2/Th17 cytokines in the peripheral blood of the patientswith blood-h(huán)eatsyndrome of psoriasis and healthy controls.Results:CD4+I(xiàn)FN-γ+was higher in the patients with blood-h(huán)eat syndrome of psoriasis than in the healthy controls,with a significant difference between the two groups(P<0.05),but the level of CD4+I(xiàn)L-4+and CD4+I(xiàn)L-17+was lower than healthy controls(P>0.05).The level of IFN-γwas higher in the patients with blood-h(huán)eat syndrome of psoriasis than in healthy controls.The level of IL-4 was lower in the patientswith blood-h(huán)eat syndrome of psoriasis than in controls(P<0.05).There was no significant difference in the level of IL-17 between the two groups(P>0.05).Conclusion:Themajor Th cell immunemechanism in blood-h(huán)eat syndrome of psoriasis was Th1 cell and themajor cytokineswas IFN-γ.

    psoriasis;blood heat syndrome;Th cells

    上海市自然基金(編號(hào):11ZR1438000)

    上海市高級(jí)中西醫(yī)結(jié)合人才培養(yǎng)計(jì)劃(編號(hào):ZYSNXD012-RC-ZXY010)

    上海市衛(wèi)生局項(xiàng)目(編號(hào):2011XY004)

    上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科,上海,200437

    ?通訊作者

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