19 種花茶提取液中總黃酮得率及其清除自由基活性的研究

任順成，常云彩，劉夢(mèng)文

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

將植物的果實(shí)、花朵或者葉泡制而成的茶水，人們稱之為“花茶”.古人已經(jīng)有了“上品飲茶，極品飲花”之說(shuō)，給予了花茶極高的評(píng)價(jià)，而現(xiàn)代亦有“男人品茶，女人飲花”的說(shuō)法.國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)和臨床研究表明花茶不僅能降低癌癥、心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，還具有美容養(yǎng)顏的特殊功效，并被用于傳統(tǒng)的鎮(zhèn)咳祛痰等治療處方中，成為了當(dāng)今主流的健康飲品[1-2].而國(guó)內(nèi)女性花茶市場(chǎng)幾乎是空白，國(guó)內(nèi)以天然花茶為主題的商品市場(chǎng)尚未形成，流行的全球花茶健康產(chǎn)品在我國(guó)還稍顯空白.目前，國(guó)內(nèi)很多地方花茶的銷售還處于超市內(nèi)售賣散裝花茶的低層次，沒(méi)有形成一種獨(dú)特的文化，滿足不了消費(fèi)者的要求.

黃酮類化合物是人們最為關(guān)注的一種天然自由基清除劑，具有抗過(guò)敏、抗氧化、消炎、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)及預(yù)防肥胖等多種藥理及保健作用[3].而且黃酮類化合物在人體內(nèi)不能直接合成，只能從食品中獲得，所以近年來(lái)科學(xué)家都積極關(guān)注從植物體中提取純度高、活性強(qiáng)的天然黃酮成分.花茶是富含黃酮類物質(zhì)的植物，作者旨在通過(guò)對(duì)不同花茶在自然沖泡條件下有效成分的浸出量及其清除游離基活性的研究，為了解常見(jiàn)花茶的功能特性提供參考.

1 材料與方法

1.1 主要材料

花茶樣品包括貢菊王、金盞菊、胎菊、紫羅蘭、金蓮花、紅巧梅、粉玫瑰、茉莉、千日紅、杭白菊、桃花、康乃馨、黃貢菊、乳菊、勿忘我、紅花、迎春花、康仙花和百合花19 種，均為鄭州市售.

1.2 主要設(shè)備

UV-2000 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SHZ-（DIII）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；HH-S 恒溫水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠；THZ-82B 恒溫振蕩器：江蘇金壇醫(yī)療儀器.

1.3 方法

1.3.1 花茶中黃酮類化合物含量的測(cè)定

1.3.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取2.5 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移到25 mL 容量瓶中定容，搖勻后得到濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液.精確吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于25 mL 容量瓶中，分別加入20 mL 0.1 mol/L 三氯化鋁甲醇溶液，定容，搖勻，10 min 后在400 nm 處測(cè)定吸光度（A），以A 為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4].

1.3.1.2 花茶提取液的制備

水提液的制備[5]：將已經(jīng)干燥好的花茶用剪刀剪碎，用數(shù)顯電子天平稱取2 g，放入錐形瓶中，按照1∶50 固液比，加入100 ℃蒸餾水，置于90 ℃恒溫水浴鍋中浸提30 min.浸提結(jié)束后趁熱用真空泵抽濾，然后定容于100 mL 容量瓶中，備用.

60%乙醇提取液的制備[6-7]：將已經(jīng)干燥好的花茶用剪刀剪碎，用數(shù)顯電子天平稱取2 g，放入錐形瓶中，按照1∶50 固液比，加入60%乙醇溶液，在300 W 功率下，微波加熱3 min.加熱結(jié)束后用真空泵抽濾，然后定容于100 mL 容量瓶中，備用.

1.3.1.3 花茶提取液中總黃酮得率的測(cè)定

取1 mL 提取液于25 mL 容量瓶中，加20 mL 0.1 mol/L 三氯化鋁甲醇溶液，定容，搖勻.10 min后，在400 nm 處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中總黃酮含量[4].

總黃酮得率＝[（Y×25V）/（M×1 000×1 000）]×100% . （1）

式中：Y 為測(cè)定的濃度，μg/mL；25 為測(cè)定時(shí)定容的體積，mL；V 為提取液的總體積，mL；M 為樣品的質(zhì)量，g.

1.3.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

吸取2 mL DPPH 貯備液，并加入2 mL 試樣液，搖勻，靜置40 min 后，以無(wú)水乙醇為空白，測(cè)定反應(yīng)體系在517 nm 處的吸光度Ai；同時(shí)測(cè)定2 mL DPPH 溶液與2 mL 無(wú)水乙醇混合液的吸光度Ac及試樣液與2 mL 無(wú)水乙醇混合液的吸光度Aj.每個(gè)樣品平行做3 次[8].

1.3.3 羥基自由基（·OH）清除能力的測(cè)定

在試管中依次加入1 mL 6 mmol/L 的硫酸亞鐵，1 mL 6 mmol/L 水楊酸-乙醇，1 mL 花茶提取液，然后加入0.1%的過(guò)氧化氫1 mL 啟動(dòng)反應(yīng)，總體積5 mL，以雙蒸水補(bǔ)足體積.其中對(duì)照管不加樣液，樣底管不加H2O2，搖勻后在37 ℃水中溫育30 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度.平行測(cè)定3 次，取平均值[9].

式中：A樣品為硫酸亞鐵+水楊酸+樣品+過(guò)氧化氫+蒸餾水的吸光度；A對(duì)照為硫酸亞鐵+水楊酸+過(guò)氧化氫+蒸餾水的吸光度；A樣底為硫酸亞鐵+水楊酸+樣品+過(guò)氧化氫+蒸餾水的吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)處理，得到回歸方程：A=0.029 2X+0.009 4，R2=0.999 1.其中，Y 為吸光度，X 為黃酮濃度（μg/mL），R2為相關(guān)系數(shù).

2.2 兩種提取條件下花茶中的總黃酮得率（表1）

表1 不同提取方法下花茶中總黃酮的得率 %

由表1 可知，在水提條件下，19 種花茶中紅花的總黃酮得率最高，為6.36%，是黃酮得率最低的千日紅（0.18%）的39 倍.在60%乙醇微波提取的條件下，紅花的總黃酮得率仍然是19 種花茶中最高的，約為5.05%，千日紅得率最低，為0.28%，紅花的總黃酮得率約為千日紅的18 倍.

在19 種花茶中，貢菊王、金蓮花、紅巧梅、桃花、康乃馨、黃貢菊、勿忘我、紅花、康仙花、杭白菊這10 種花茶在水提條件下的總黃酮得率大于在60%乙醇條件下提取的，而金盞菊、胎菊、紫羅蘭、粉玫瑰、茉莉、千日紅、百合花、乳菊、迎春花這9種花茶在醇提條件下的總黃酮得率較水提更高.多數(shù)黃酮類物質(zhì)易溶于水、乙醇、甲醇等極性較強(qiáng)的溶劑中.水的極性較乙醇更強(qiáng)，之所以會(huì)出現(xiàn)上述含量上的差別，是因?yàn)槊糠N花茶中所含有的黃酮類物質(zhì)的種類和結(jié)構(gòu)不盡相同，在不同的溶劑、不同的方法下所提取出的物質(zhì)會(huì)發(fā)生一定的變化[10-11].

2.3 花茶黃酮類提取液清除自由基活性研究

2.3.1 DPPH 自由基清除能力

水提條件下19 種花茶提取液對(duì)DPPH·的清除率見(jiàn)圖1.

60%乙醇提取條件下19 種花茶提取液對(duì)DPPH·的清除率見(jiàn)圖2.

圖1 水提條件下19 種花茶提取液對(duì)DPPH·的清除率

圖2 60%乙醇提取條件下19 種花茶提取液對(duì)DPPH·的清除率

由圖1 和圖2 可知，對(duì)于在相同體積的待測(cè)樣品，每種花茶都對(duì)DPPH·有著較強(qiáng)的清除能力.不論是在水提液還是醇提液中，千日紅的DPPH·清除率都是最高，分別為98.31%和99.31%，最低的為杭白菊，分別為82.18%和81.17%，二者對(duì)DPPH·的清除能力也都很強(qiáng).曾佑煒等[5]測(cè)定了16種花茶對(duì)DPPH·的清除能力，其中紅花對(duì)DPPH·的清除率僅有50.70%，其原因可能是由于花茶的浸提時(shí)間過(guò)短（5 min），沒(méi)有將黃酮類化合物充分浸提出來(lái)，也可能是由于原料產(chǎn)地或品種不同所致.

2.3.2 羥基自由基（·OH）清除能力

水提條件下19 種花茶提取液對(duì)·OH 的清除率見(jiàn)圖3.

圖3 水提條件下花茶提取液對(duì)·OH 的清除率

60%醇提條件下19 種花茶提取液對(duì)·OH 的清除率見(jiàn)圖4.

結(jié)果表明，在水提液中，對(duì)·OH 清除能力最強(qiáng)的是百合花，清除率為75.65%，最弱的為勿忘我，清除率為25.86%；用60%乙醇為提取液時(shí)，對(duì)·OH清除力最強(qiáng)的是金蓮花，為65.83%，最弱的是康乃馨，清除率為17.16%，不同種花茶之間對(duì)·OH 的清除率相差很大.

19 種花茶提取液清除游離基活性不同的原因主要有：不同提取條件下的每種花茶提取液都可能含有不同的黃酮類化合物.不同的黃酮類化合物對(duì)不同體系的抗氧化作用可能不同，對(duì)不同自由基和不同組織的作用也存在一定的選擇性，而且黃酮類化合物清除·OH 與DPPH·的活性部位和作用機(jī)制也不完全相同，因此，這可能是造成花茶總黃酮對(duì)兩種自由基清除效果不同的原因[12-14].而且在不同的提取條件下，所提取出的黃酮類化合物的含量、種類及特性有所不同，另外，這19 種花茶的粗提液中可能含有一些酚類物質(zhì)及其他抗氧化成分，在不同的提取工藝下，這些抗氧化物質(zhì)的特性及含量也有區(qū)別，它們對(duì)自由基的清除能力存在一定的選擇性，在抗氧化體系中發(fā)揮的作用也不盡相同，所以會(huì)造成上述清除游離基活性的差別[15-17].

圖4 60%乙醇提取條件下花茶提取液對(duì)·OH 清除率

2.3.3 花茶提取液中總黃酮得率與自由基清除率的相關(guān)性

用SPSS16.0 軟件對(duì)花茶提取液總黃酮得率與DPPH·、·OH 清除率之間進(jìn)行單因素方差分析，用P 值表示相關(guān)性是否顯著，P＞0.05 代表不顯著，P＜0.05 代表具有顯著性，P＜0.01 代表極顯著，結(jié)果見(jiàn)表2 和表3.

由表2 和表3 可知，水提條件下，花茶提取液中總黃酮得率與DPPH·清除率沒(méi)有明顯相關(guān)性，P值為0.169，但與·OH 清除率之間存在一定的相關(guān)性，P 值為0.015.60%乙醇提取條件下，花茶提取液的總黃酮得率與DPPH·和·OH 清除率之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性，P 值分別為0.078 和0.075；不論在水提條件下還是醇提條件下，DPPH·和·OH 清除率之間都沒(méi)有明顯相關(guān)性，P 值分別為0.253 和0.799.之所以黃酮得率與DPPH·和·OH 清除率之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性，其原因可能是由于花茶中還含有其他的抗氧化成分，譬如酚類物質(zhì)、維生素等.

表2 水提條件下單因素方差分析

表3 60%乙醇提取條件下的單因素方差分析

3 結(jié)論

在19 種花茶提取液中，紅花、黃貢菊、粉玫瑰、金蓮花的總黃酮得率較高，均在3%以上，千日紅和百合的總黃酮得率較低，在1%以下；每種花茶都對(duì)DPPH·有著較強(qiáng)的清除能力，清除率在80%以上；百合花對(duì)羥基自由基的清除率較強(qiáng)，但是胎菊、粉玫瑰、黃貢菊、乳菊、勿忘我、康仙花和杭白菊對(duì)羥基自由基的清除率較低.不同種類花茶提取液之間的總黃酮得率差異比較大，并且在水提條件下和醇提條件下的黃酮得率差異明顯.千日紅中的總黃酮得率在19 種花茶提取液中是最低的，但是對(duì)DPPH 自由基的清除率卻最強(qiáng).花茶提取液的總黃酮得率與DPPH·和·OH 清除率之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性，這說(shuō)明花茶的抗氧化活性并不完全取決于其總黃酮，還可能和其他抗氧化成分，譬如總酚等有關(guān)，有待深入研究.

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