細菌纖維素產生菌的篩選、鑒定及其產物分析

鄧毛程，王 瑤，李 靜，吳永輝，張遠平

（1.廣東輕工職業(yè)技術學院 食品與生物工程系，廣東 廣州 510300；2.廣州倚德生物科技有限公司，廣東 廣州 510300；3.廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東 廣州 510316）

0 引言

細菌纖維素（Bacterial cellulose，簡稱BC）是由微生物（主要是細菌）合成的細胞外纖維素，在結晶度、化學純度、抗張強度、彈性模量、吸水性和生物相容性等方面均優(yōu)于植物纖維素，被認為是一種性能優(yōu)異的新型天然生物納米材料[1-2].近年來，細菌纖維素的研究成為當今微生物合成材料領域的熱點之一，并在生物醫(yī)藥、組織工程支架材料、聲學器材、食品、化妝品、造紙等領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力[3-4].但是，自從1886 年英國科學家Brown[5]發(fā)現(xiàn)細菌纖維素以來，由于細菌纖維素生產一直處于發(fā)酵產率低、生產成本高的狀況，使其應用受到很大的局限[6].為了提高細菌纖維素的發(fā)酵產率，筆者從自然發(fā)酵的椰子水中篩選、鑒定細菌纖維素高產菌株，并對其發(fā)酵產物進行分析，期望能夠為細菌纖維素的研究和生產提供優(yōu)良菌種.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篩選材料：經自然發(fā)酵產膜的椰子水，采樣于海南??；新鮮椰子水：成熟椰子破殼取水；DNA 提取試劑盒、16S rDNA 的擴增引物以及PCR 擴增試劑等：深圳華大基因科技服務公司；其他試劑均為市售.

1.2 儀器與設備

SPX-100B-Z 型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TS-211C 型振蕩培養(yǎng)箱：上海天呈實驗儀器制造有限公司；SHZ-82A 型恒溫水浴振蕩器：江蘇省太倉醫(yī)療器械廠；KDC-210HR 高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；S-3000N 掃描電鏡：日本日立公司；VERTEX70 傅立葉紅外光譜儀：德國布魯克公司.

1.3 平板分離

固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，瓊脂20 g/L，新鮮椰子水50%（V/V），調節(jié)pH 至5.5，121 ℃滅菌20 min.按固體培養(yǎng)基配方制備平板，備用.在無菌條件下，將表面的菌膜從自然發(fā)酵椰子水中取出，剪取2 g 放入無菌試管中，加入10 mL 無菌水，置于渦旋振蕩器上振蕩5 min，再將懸液進行梯度稀釋，涂布于平板培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)，然后挑取顆粒飽滿的單個菌落，接入斜面培養(yǎng)基進行培養(yǎng)和保藏.

1.4 發(fā)酵篩選

液體培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，新鮮椰子水50%（V/V），調節(jié)pH 至5.5，121 ℃滅菌20 min.將液體培養(yǎng)基分裝至250 mL 三角瓶中，每瓶裝液100 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻后，將挑取菌落的斜面菌種接入液體培養(yǎng)基，每瓶接入1 環(huán)，恒溫30℃靜置培養(yǎng)240 h，觀察各菌株的產膜情況，并測定各瓶的細菌纖維素產量，根據測定結果優(yōu)選出目標菌株.

1.5 菌種鑒定

采用革蘭氏染色顯微鏡觀察法和掃描電鏡觀察法[7]鑒定菌種形態(tài)特征；按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）的方法[8-9]，鑒定菌種的生理生化特征；參照文獻[10]的方法，對菌種的16S rDNA 進行鑒定.在16S rDNA鑒定過程中，采用1 對通用引物（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和5′-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3′）對菌種的16S rDNA 進行擴增，PCR 產物送至深圳華大基因科技服務公司測序，然后在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）中進行同源性檢索，并采用MEGA5.1 軟件以Neighborjoining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.6 產物定性分析

用清水將目標菌株的凝膠膜狀產物洗凈，浸泡于0.1 mol/L 的NaOH 溶液中煮沸30 min，用蒸餾水漂洗至中性，再置于105 ℃下進行干燥.產物的初步定性分析采用蒽酮顯色法[11]，即稱取干燥后的產物0.1 g，加入2～4 ℃60%硫酸溶液100 mL，于冰浴中消化2 h，然后在比色管中分別加入消化液4 mL 和2%蒽酮1 mL，觀察顯色結果.另外，產物特征官能團的分析采用傅里葉紅外光譜（FTIR）法[12-13]，即將干燥后的產物與KBr 混合，研磨成粉末，經壓片，通過傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1區(qū)間內進行掃描，測定產物的紅外吸收光譜，分析產物的官能團特征.

1.7 產物結構分析

參照文獻[14]的掃描電鏡法，利用掃描電鏡觀察產物的微結構.

1.8 細菌纖維素產量的測定

采用稱重法[15]測定細菌纖維素的產量，即用清水將凝膠膜狀產物洗干凈，放入0.1 mol/L NaOH溶液中煮沸30 min，用蒸餾水漂洗至中性，于105℃的條件下干燥至恒重，然后準確稱量干燥物的質量.

2 結果與討論

2.1 菌種的篩選

從分離平板上挑取顆粒飽滿的菌落52 個，經過發(fā)酵復篩試驗，其中凝膠膜產量居于前9 位菌株的發(fā)酵結果如圖1 所示.可以看出，這9 種菌株的細菌纖維素產量分布在4.52～10.80 g/L 的范圍內，產量排序為：BC13＞BC07＞BC19＞BC26＞BC10＞BC28＞BC02＞BC37＞BC41.菌種BC13 的細菌纖維素產量最大，故被確定為進一步研究的優(yōu)選菌種.

圖1 9 種菌株的細菌纖維素產量

2.2 菌種形態(tài)與生理生化特性的鑒定

經革蘭氏染色和顯微鏡觀察，菌種BC13 呈陰性.如圖2 和圖3 所示，在透射電鏡（×7 000）和掃描電鏡（×10 000）下觀察，菌體呈橢圓的桿狀，大小為（0.4～0.6）μm ×（1.3～2.8）μm，周生鞭毛.菌種BC13 的生理生化特征試驗結果見表1，根據《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》的描述，初步鑒定菌種BC13 為醋桿菌屬.

圖2 菌種BC13 在透射電鏡下的菌體形態(tài)（×7 000）

圖3 菌種BC13 在掃描電鏡下的菌體形態(tài)（×10 000）

2.3 菌種16S rDNA 的鑒定

菌種BC13 的16S rDNA 的PCR 擴增產物大小為1 453 bp，將此序列在NCBI 中進行Blast 比較后，發(fā)現(xiàn)菌種 BC13 與葡糖酸醋桿菌屬（Gluconacetobacter）許多菌種的同源性達99%以上，與其同源性達到100%的葡糖酸醋桿菌有Gluconacetobacter xylinus 1-18（登錄號：KF030731.1）和 Gluconacetobacter xylinus G7 -3（登錄號：KF030791.1）.如圖4 所示，采用Neighbor-joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，也可以發(fā)現(xiàn)菌種BC13 與Gluconacetobacter xylinus 1-18 的親緣關系最接近.將菌種BC13 的形態(tài)、生理生化等特征與16S rDNA鑒定結果結合起來，可最終確定菌種BC13 為木葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）.

表1 生理生化試驗結果

圖4 菌種BC13 序列系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 產物的定性分析

菌種BC13 的凝膠膜狀產物在0.1 mol/L 的NaOH 溶液中煮沸30 min，沒有發(fā)生溶解；其干燥物經60%硫酸消化和蒽酮試劑顯色，呈綠色，這與蒽酮顯色法鑒定纖維素的原理吻合，可以初步判斷凝膠膜狀產物的主要成分為纖維素.發(fā)酵產物的紅外光譜見圖5.由圖5 可見，3 584 cm-1處的吸收峰是由O—H 伸縮振動所致，2 896 cm-1處的吸收峰是大分子中C—H 伸縮振動所致，1 664 cm-1處的吸收峰是由纖維素4′端的半縮醛基的伸縮振動所致，1 555 cm-1、1 427 cm-1和1 336 cm-1處的吸收譜帶是C—H 的彎曲振動所產生，1 205 cm-1和1 061 cm-1處的吸收譜帶是由C—O 的伸縮振動所產生.圖5 表明，發(fā)酵產物可能含有與纖維素結構相符合的基團，其紅外光譜的特征與相關文獻中細菌纖維素的紅外光譜基本一致[1，6，16]，因而可進一步推斷發(fā)酵產物是細菌纖維素.

2.5 產物的結構分析

在掃描電鏡（×8 000）下觀察產物的超微結構如圖6 所示.由于經過堿水煮沸處理，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)菌體殘留在產物中.產物呈現(xiàn)出由微纖維相互纏繞形成的致密網狀結構，纖維絲直徑不足100 nm.圖6 的超微結構與相關文獻中細菌纖維素的掃描電鏡照片[6，17]十分相似.

圖5 菌種BC13 產物的傅里葉紅外光譜

圖6 菌種BC13 產物的超微結構

3 結論

以自然發(fā)酵的椰子水為篩選材料，采用平板分離、靜態(tài)發(fā)酵等方法篩選獲得細菌纖維素產量為10.8 g/L 的菌株BC13.經過形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA 等方面的分析，鑒定菌株BC13為木醋桿菌.采用蒽酮顯色法、紅外光譜法對菌株BC13 的發(fā)酵產物進行定性分析，同時采用掃描電鏡對其超微結構進行觀察，可推斷菌株BC13 的發(fā)酵產物為細菌纖維素.菌株BC13 產纖維素能力較高，是一株具有應用潛力的菌株，為了使其更好地應用于細菌纖維素的研究和生產，其發(fā)酵工藝仍需進一步優(yōu)化.

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