股骨干骨折合并腦損傷后大鼠肺臟炎性介質(zhì)與SP-A變化的實驗研究

劉 鋼，宋耀宗，于 晨，劉 佳，孫天勝※

(1.解放軍醫(yī)學院，北京 100853； 2.北京軍區(qū)總醫(yī)院骨科，北京 100700)

隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，工業(yè)、交通事故及突發(fā)災(zāi)難導致的多發(fā)傷顯著升高。多發(fā)傷中四肢損傷合并腦損傷占有相當大的比例，Probst等[1]回顧性調(diào)查顯示，4849例多發(fā)創(chuàng)傷患者中合并腦損傷者達65%。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/成人呼吸窘迫綜合征(adult respiratory distress syndrome,ARDS)是這類多發(fā)傷嚴重并發(fā)癥及主要死亡原因。因此，在多發(fā)傷的救治中，預(yù)防肺臟并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展是降低致殘、死亡的關(guān)鍵。目前尚沒有文獻從蛋白組學、炎癥學說層面對不同創(chuàng)傷模型早期引起的ALI/ARDS進行同步研究。本實驗在三種不同創(chuàng)傷模型中，對不同時點間肺組織肺表面活性蛋白A(surfactant protein-A,SP-A)和炎性介質(zhì)進行定量分析，為正確認識多發(fā)傷后ALI/ARDS及選擇合理手術(shù)時機提供參考資料。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD雄性大鼠，購于軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心。SD雄性大鼠108只，體質(zhì)量250～300 g，采用隨機數(shù)字表法分為空白對照組(12只)、股骨干骨折組(32只)、腦損傷組(32只)、股骨干骨折合并腦損傷組(32只)。

1.2方法

1.2.1動物模型制備 腦損傷致傷方法:本實驗采用改進的Feeney′s自由落體硬膜外撞擊方法[2]，致重度腦損傷，記錄打擊時間。股骨干閉合骨折致傷方法:參照Einhorn動物骨折造模法支架理念，根據(jù)標準骨折模型制作方法[3-4]，致股骨干閉合骨折，記錄打擊時間。

1.2.2取材 分別于致傷后1、6、12、24 h取右肺臟下葉組織，于液氮中凍存。標本全部收集完畢后，于液氮中取出凍存肺組織100 mg放入研磨器中，加入1 mL Buffer裂解液于冰上裂解1 h,研磨。4 ℃離心10 min(16 000 r/min，離心半徑10 cm)，取上清液分裝于EP管中，-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3Western Blot檢測SP-A相對量 蛋白定量法測定肺組織勻漿蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整樣本濃度均勻一致。各組以聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(12%分離膠和4%濃縮膠)，通過半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，恒壓23 V轉(zhuǎn)膜45 min；PVDF膜經(jīng)封閉液封閉1 h，加入一抗：SP-A一抗用TBST(Tris鹽緩沖液+Tween+Nacl)緩沖液1∶1000稀釋，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜4次，每次10 min；加入二抗(1∶1000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；超敏發(fā)光液化學發(fā)光，顯影、定影、拍照；凝膠成像儀分析系統(tǒng)分析掃描灰度值，計算目的蛋白與β肌動蛋白灰度值的比值。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測炎性介質(zhì)水平 取樣本上清液，按照白細胞介素(interleukin,IL)6、IL-10和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測IL-6、IL-10和TNF-α水平。

2 結(jié) 果

2.1Western Blot檢測肺組織勻漿SP-A表達 創(chuàng)傷后，SP-A隨損傷程度的不同發(fā)生顯著變化,6 h時骨折組、腦損傷組、骨折合并腦損傷組SP-A水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；12 h時，骨折組和骨折合并腦損傷組均出現(xiàn)SP-A下降；24 h時，骨折組降至接近對照組，腦損傷組仍然持續(xù)升高，骨折合并腦損傷組降至對照組之下，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。骨折組6 h SP-A水平達高峰，12 h出現(xiàn)下降，至24 h時與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；腦損傷組均呈上升趨勢，與對照組和骨折組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；骨折合并腦損傷組SP-A水平6 h達高峰，12 h出現(xiàn)下降，24 h降至對照組之下(P<0.05)(表1、圖1)。

2.2ELISA檢測各組肺組織炎性介質(zhì)

2.2.1各組肺組織TNF-α水平的比較 三組創(chuàng)傷模型后TNF-α水平均升高，以骨折合并腦損傷組最高，6 h時骨折組、腦損傷組、骨折合并腦損傷組升高幅度最大，其中仍然以骨折合并腦損傷組最高，12 h、24 h出現(xiàn)下降趨勢，但損傷程度較重的骨折合并腦損傷組TNF-α水平仍然顯著高于其他兩組(P<0.05)(表2)。

表1 各組不同時點間肺組織SP-A水平的比較 (ng/L)

SP-A：肺表面活性蛋白A

C：對照組；G：骨折組；N:腦損傷組；G+N:骨折合并腦損傷組；SP-A：肺表面活性蛋白；β-actin：肌動蛋白

圖1各組不同時點間SP-A變化

表2 各組不同時點間肺組織TNF-α水平的比較 (ng/L)

TNF-α:腫瘤壞死因子α

2.2.2各組肺組織IL-6水平的比較 三組創(chuàng)傷模型后IL-6水平均升高，以骨折合并腦損傷組最高；6 h時骨折組、腦損傷組、骨折合并腦損傷組IL-6水平升至最高，之后出現(xiàn)下降趨勢，但24 h腦損傷組和骨折合并腦損傷組又升高，骨折組在24 h時IL-6水平接近正常(P<0.05)；損傷程度較重的骨折合并腦損傷組L-6水平各時間點仍然顯著高于骨折組、腦損傷組(P<0.05)(表3)。

表3 各組不同時點間肺組織IL-6水平的比較 (ng/L)

IL-6:白細胞介素6

2.2.3各組肺組織IL-10水平的比較 三組創(chuàng)傷模型后IL-10水平均升高，其中骨折合并腦損傷組IL-10水平最高，骨折合并腦損傷組與其他三組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。24 h時骨折組出現(xiàn)下降趨勢，而腦損傷組和骨折合并腦損傷組仍然繼續(xù)升高(P<0.05)(表4)。

表4 各組不同時點間肺組織IL-10水平的比較 (ng/L)

IL-10:白細胞介素10

3 討 論

ARDS是ALI的嚴重形式，ARDS進一步發(fā)展即為呼吸衰竭。目前對于多發(fā)傷引起的ALI/ARDS的具體機制尚不清楚。多數(shù)研究認為，與創(chuàng)傷后炎癥細胞因子分泌增強，引發(fā)一系列瀑布炎性反應(yīng)過程，肺泡上皮細胞廣泛破壞有關(guān)[5]。嚴重創(chuàng)傷后會發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征,釋放多種炎性介質(zhì)，如TNF-α、IL-6等。TNF-α是炎性反應(yīng)的始動因子和最重要內(nèi)源性介質(zhì)，導致IL-6、IL-10等釋放,過量TNF-α等炎性因子在體內(nèi)大量產(chǎn)生和釋放會破壞機體免疫平衡，產(chǎn)生多種病理損傷，形成級聯(lián)放大的瀑布樣惡性循環(huán)，導致ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展[6-7]。

肺泡表面活性物質(zhì)系統(tǒng)異常亦是ALI發(fā)病的重要原因。肺泡表面活性物質(zhì)是由肺泡Ⅱ型上皮細胞合成和分泌的脂質(zhì)和蛋白復(fù)合物，能減少肺氣液界面表面張力，提高肺泡穩(wěn)定性和防止呼氣相肺泡塌陷[8]。SP-A是最早發(fā)現(xiàn)并且是在肺泡Ⅱ型上皮細胞中強烈表達、信號最為豐富的蛋白，它是肺表面活性物質(zhì)的重要組分之一，約占蛋白總量的50%以上，在調(diào)節(jié)磷脂代謝及局部免疫防御方面意義重大,是反映Ⅱ型細胞功能的早期指標，也是判斷患者肺損傷程度和預(yù)后的指標[9]。肺損傷時肺泡表面活性物質(zhì)繼發(fā)性缺乏或滅活，尤其是其相關(guān)活性蛋白的改變，更促進肺損傷的發(fā)生、發(fā)展，形成惡性循環(huán)。

本實驗中創(chuàng)傷后肺組織炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-10 水平明顯升高，嚴重創(chuàng)傷后(股骨干骨折合并腦損傷組)炎性介質(zhì)升高最明顯，表明嚴重創(chuàng)傷后炎性反應(yīng)激烈。創(chuàng)傷后各研究組SP-A水平發(fā)生顯著變化，說明創(chuàng)傷后會引起SP-A代償性增加，嚴重創(chuàng)傷發(fā)生失代償時SP-A水平下降。

綜上所述，創(chuàng)傷后肺臟組織出現(xiàn)炎性介質(zhì)、SP-A水平改變，炎性介質(zhì)及SP-A水平與創(chuàng)傷程度密切相關(guān)。嚴重創(chuàng)傷后發(fā)生了全身炎性反應(yīng)綜合征，產(chǎn)生了大量炎性介質(zhì)，對肺臟組織造成損傷，造成SP-A失代償性減少，進一步加重了肺損傷，導致ALI/ARDS發(fā)生、發(fā)展，是創(chuàng)傷后發(fā)生ALI/ARDS甚至呼吸衰竭的重要因素。

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