食管癌中人乳頭狀瘤病毒感染與p53的相關(guān)性研究

任 玉

(鹽亭縣腫瘤醫(yī)院病理科，四川 鹽亭 621600)

食管癌是目前常見的十大惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率也相對較高。導致食管癌的因素較多，如不良飲食習慣，環(huán)境因素等均是食管癌的高危因素。另外，隨著臨床對于惡性腫瘤發(fā)病機制的研究等，發(fā)現(xiàn)個體因素(如基因表達等)也會在某種程度上影響惡性腫瘤的發(fā)生。人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)為雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒，是一種高度的特異性的上皮性病毒。大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，p53基因突變與腫瘤發(fā)生有一定關(guān)系，p53基因突變者中發(fā)生腫瘤病變的患者比例約為50.0%，p53是目前與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因[1]。p53蛋白的主要生理功能是特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，是細胞生長周期的一種負調(diào)節(jié)因子。其主要主導細胞周期的調(diào)控，各種細胞的分化以及DNA的修復等。本研究主要探討食管癌患者的HPV和p53表達的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年3月至2012年3月鹽亭縣腫瘤醫(yī)院收集的食管癌患者的組織石蠟標本共80例，男59例、女21例，年齡51～70歲,其中≤60歲的患者47例、>60歲的患者33例。TNM分期標準為：Ⅰ期39例，Ⅱ期28例，Ⅲ期13例。64例患者無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，16例患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2方法

1.2.1試劑 采用的p53單克隆抗體和免疫組織化學染色超敏試劑盒由Maxim Bistech公司生產(chǎn)。鼠抗HPV的單克隆抗體，克隆號為BVP-1/H8+CAMVIR,由上海太陽生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.2HPV檢測 采用活檢取樣的方法分別收集入選患者的癌組織、癌旁組織以及正常的食管黏膜組織。食管癌標本為石蠟標本，其制作過程是采用4%等的中性甲醛固定，然后4 μm切片同石蠟包埋然后再進行免疫組織化學檢測。將收集的標本放置于干燥的離心管中先進行離心約3 min，轉(zhuǎn)速為5000 r/m(離心半徑為6 cm),棄將上層清液，再將細胞保存液加入離心管中進行震蕩混勻，通過Thinprep系統(tǒng)處理后制備成2 cm的薄層細胞涂片。涂片需要用95%的乙醇固定，加入蘇木精-伊紅染色，封固。

1.2.3p53檢測 采用鼠抗人p53單克隆抗體以及免疫組織化學染色超敏試劑盒進行檢測。將組織切片進行p53免疫組織化學染色，各種操作均嚴格按照說明書進行。首先需要將石蠟切片進行脫蠟以及水花操作，然后采用枸櫞酸緩沖抗原修復液進行高溫抗原修復，然后加入過氧化物酶進行阻斷，滴加正常的非免疫動物血清后再滴加第一抗體和生物標志物的第二抗體。然后再滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶試劑、帶樣品制備好后再加入DNA顯示劑以及蘇木精進行復染，再用中性樹膠進行股份。磷酸鹽緩沖液做空白對照，陽性對照則采用已知的陽性樣本。

1.3結(jié)果判定標準 根據(jù)試劑盒的說明進行操作，當出現(xiàn)棕褐色顆粒則為雜交陽性信號，但出現(xiàn)棕褐色或者棕黃色顆粒則為p53陽性信號。在高倍鏡下選擇5個視野，每個視野需要包含有200個細胞，計算樣本的陽細胞百分比。其中根據(jù)陽細胞百分比具體的判斷結(jié)果如下：(-)為無陽性細胞；(+)陽細胞比例≤25%；(++)陽細胞比例在25%～50%；(+++)說明陽細胞比例≥50%[2]。

HPV結(jié)果判斷;有棕黃色顆粒沉重，胞質(zhì)核出現(xiàn)著色，則為陽性結(jié)果；而胞核，胞質(zhì)不著色或者自由胞質(zhì)著色的則判斷為陰性。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS 16.0統(tǒng)計析軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗,相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1HPV感染和p53表達檢查的結(jié)果 癌組織樣本中，HPV陽性率為22.5%，癌旁組織的HPV陽性率為47.5%，正常組織的陽性率為6.25%，三種組織樣本陽性率對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而p53表達顯示，癌組織的陽性率為91.3%，而癌旁組織為51.3%，正常組織為2.5%，三種組織樣本陽性率對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。其中HPV陽性樣本如圖1 所示，p53表達陽性樣本如圖2所示。

表1 HPV感染和p53表達檢測結(jié)果 [例(%)]

圖1 圖2

圖1HPV陽性樣本(免疫組織化學法，×1000)圖2p53表達陽性樣本(免疫組織化學法，×1000)

2.2食管癌HPV感染和p53表達與患者的臨床癥狀的相關(guān)性 患者不同年齡、性別、TNM分期以及淋巴轉(zhuǎn)移與否的HPV感染和p53表達的陽性率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

2.3食管癌HPV感染和p53表達的相關(guān)性 Spearman相關(guān)結(jié)果顯示，HPV感染與p53表達呈正相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表2 食管癌HPV和p53表達與患者臨床癥狀的相關(guān)性 (例)

表3 食管癌HPV感染和p53表達的相關(guān)性 (例)

3 討 論

食管癌的發(fā)生是一種多階段以及多基因的復雜過程，因此食管癌患者的初次診斷時已經(jīng)是疾病的中期或者晚期，使預后效果大大降低。近年來臨床對于食管癌等的發(fā)病機制進行研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，由于基因的表達以及各種細胞增殖和凋亡機制會嚴重影響疾病的發(fā)展和進程。大量的臨床研究資料發(fā)現(xiàn)，細胞的增殖和凋亡作用的失衡是導致惡性腫瘤發(fā)生的重要高危因素[3]。

p53基因蛋白是一種抑癌基因，當細胞的DNA發(fā)生損傷時，它的主要作用是能夠使細胞在G1/S期分裂終止，使細胞能夠得到充分的修復。若細胞的損傷過大，不能修復，則會進入細胞的自動凋亡期而引起細胞的死亡。因此，當p53基因出現(xiàn)失活或表達異常時，細胞的生長抑制作用會丟失，使細胞出現(xiàn)惡性病變的細胞過度增殖，從而發(fā)展成為惡性腫瘤細胞。p53可以作為惡性腫瘤診斷的重要檢測項目，并且可以作為早期診斷的重要指標。目前，p53是人類腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的表達基因，其相關(guān)性高達50%以上。這主要是由于p53會在腫瘤發(fā)生的早期出現(xiàn)表達，p53蛋白可以作為體液或者細胞免疫識別的靶抗原，在正常的非腫瘤健康人群中很少出現(xiàn)該抗體。因此,p53可以作用一種早期診斷的新腫瘤標志物。p53有兩種類型的表達，意識野生型和突變型[4-7]，其中野生型p53蛋白是通過誘導細胞凋亡而起到抑制腫瘤的作用；而突變型的p53則是通過誘導細胞的凋亡能力，使細胞的惡性轉(zhuǎn)化能力增強。因此,在惡性腫瘤患者中常可以檢測到有突變型的p53蛋白基因表達[8]。

當人感染HPV后會進入消化道，從而產(chǎn)生特異性的黏膜上皮和粘連的適應性。因此，可使HPV在患者的食管中會有短暫的停留，病毒有可能會黏附在患者的黏膜和食管上皮細胞上[9-11]。本研究結(jié)果顯示，食管癌患者中HPV感染陽性率為22.5%，癌旁組織的陽性率則高達47.5%，可能是HPV的持續(xù)感染造成的食管癌發(fā)生。本研究結(jié)果還顯示，食管癌患者HPV感染以及p53的表達有一定的相關(guān)性。目前的臨床研究發(fā)現(xiàn)，HPV感染后與p53蛋白會形成一種復合物，從而使p53的抑癌作用大大降低，活性消失，使細胞出現(xiàn)無限增殖，推測這可能是HPV感染后導致惡性腫瘤發(fā)病的原因之一[11]。目前，關(guān)于食管癌中HPV感染和p53表達間仍存在一定的爭議性，因此兩者間的相關(guān)性等聯(lián)系還需要更進一步的資料來完善。臨床上需要推進食管癌發(fā)病機制的研究以及HPV的生物學特性研究，以期對臨床的早期預防、診斷和治療食管癌等提供相關(guān)的臨床理論支持和引導。

綜上所述，對食管癌患者進行HPV檢測和p53表達的檢測有助于臨床上對于食管癌的診斷和指導臨床治療，兩種檢測指標均有可能與食管癌的發(fā)病機制有相關(guān)的作用，應予以重視。

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