白藜蘆醇對果蠅壽命影響及抗氧化機制研究

付 暉，肖建民

(1.廣東醫(yī)學院藥理教研室，廣東 東莞 523808； 2.東莞市太平人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 東莞 523905)

白藜蘆醇又名芪三酚，是含有芪類結(jié)構的非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于葡萄、松樹、虎杖、決明子以及花生等天然植物或果實中，到目前為止至少在21科、31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)。白藜蘆醇是許多植物受到生物或非生物脅迫(如真菌感染、紫外照射等)時產(chǎn)生的一種植物抗毒素，其具有很強的生物學作用，同時也是一種天然的抗氧化劑，其作用范圍比較廣泛[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抗癌、保護心血管、抗血栓、抗氧化、抗菌、抗病毒及延長壽命等作用[2-8]。此外，白藜蘆醇還能減輕多種因素所導致的組織器官損傷，并具有保護肝細胞的作用[9-10]。本研究擬進一步探討白藜蘆醇對果蠅壽命的影響及其抗氧化作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 本研究所用果蠅為野生型Oregon K品系黑腹果蠅，由華中師范大學提供，在本實驗室擴大繁殖并備用。實驗室室溫為20～25 ℃，生化培養(yǎng)箱溫度(25±1) ℃，濕度為45%～65%。果蠅的培養(yǎng)液為含有玉米、糖、干酵母和瓊脂的玉米飲食，標準飲食含有10%糖、10%酵母以及1.5%瓊脂。本研究所用小鼠為雄性清潔級成年昆明種小鼠100只。

1.2實驗儀器和試劑 實驗儀器：生化培養(yǎng)箱(上海博訊，SPX-150BZ)、組織勻漿器、離心機、振蕩器、移液泵、沸水浴、多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)、電子天平。試劑：血清/組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒均購自南京建成生物試劑公司；白藜蘆醇(純度>99%)由上海納貝生物技術有限公司提供。

1.3方法

1.3.1果蠅的生存實驗 收集8 h內(nèi)新羽化的果蠅成蟲，用CO2麻醉后將雌雄分開，用普通培養(yǎng)液飼養(yǎng)14 d。取14 d齡的備用果蠅，采用計算機隨機分組法分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組雄性果蠅100～120只，雌性果蠅150～200只。對照組用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)，3個實驗組用含有不同濃度的白藜蘆醇培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中低劑量組的劑量為100 μmol/L，中劑量組為200 μmol/L，高劑量組為400 μmol/L。記錄每24小時果蠅的死亡只數(shù)，每4天更換1次培養(yǎng)液，直至果蠅全部死亡，分別計算果蠅平均壽命、平均最高壽命、半數(shù)死亡時間等指標。平均壽命是每組果蠅死亡日齡的算術平均數(shù)，平均最高壽命為每組最后10只果蠅死亡日齡的算術平均數(shù)，半數(shù)死亡時間為每組50%的果蠅死亡時的日齡。

1.3.2抗氧化實驗 將100只健康雄性小鼠(月齡1.5～2.5個月)按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、溴代苯模型對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組20只，每組小鼠體質(zhì)量、平均體質(zhì)量及月齡，平均月齡情況分別為：對照組19.8～28.5(24.2±3.5) g，1.5～2.4(1.9±0.3)個月；模型組20.1～28.0(23.9±3.7) g，1.6～2.5(2.1±0.4)個月；低劑量組21.1～29.1(25.2±3.6) g，1.5～2.5(2.0±0.4)個月；中劑量組21.3～29.4(25.5±4.0) g，1.6～2.5(2.1±0.4)個月；高劑量組19.3～29.2(24.7±4.3) g，1.5～2.4(1.9±0.3) 個月，各組間小鼠體質(zhì)量及月齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)具有均衡性。3個給藥組分別予以低、中、高不同劑量的白藜蘆醇[分別為22 mg/(kg·d)，44 mg/(kg·d)，88 mg/(kg·d)]連續(xù)灌胃30 d。30 d后取血檢測抗氧化酶水平，包括全血GSH-Px、SOD及MDA，然后將動物饑餓過夜。第2日除空白對照組外，各組小鼠均經(jīng)口給予溴代苯油0.47 g/kg，灌胃量0.2 mL/20 g，制造肝臟脂質(zhì)過氧化損傷模型。20 h后處死動物，取肝組織測MDA水平和抗氧化酶活力。

1.3.3抗氧化能力測定指標

1.3.3.1血清樣品 雙側(cè)眼眶內(nèi)眥部位取血0.5 mL，以離心半徑16 cm、2000 r/min離心15 min，取上清備用。

1.3.3.2全血樣品 取肝素抗凝全血10 μL，以蒸餾水稀釋至1 mL，配成1∶99的溶血液。充分混勻，放置5 min直至玻璃管中的溶血液對光呈完全透明狀，4 ℃冰箱保存，2～3 d內(nèi)測全血GSH-Px酶活性。

1.3.3.3肝組織上清液 動物處死后立即取出所需肝臟，放入冷生理鹽水中洗去浮血。剔除脂肪及結(jié)締組織，濾紙吸干后在冰浴上剪成碎片。稱取適量組織，以組織勻漿器勻漿10 s，間歇10 s，反復3次制成10%組織勻漿，然后以離心半徑16 cm、12500 r/min離心10 min，取上清液備用，操作均在冰浴中進行。

1.3.3.4各項指標測定 測定全血GSH-Px的水平、血清SOD和MDA及肝組織中GSH-Px、MDA和SOD的水平。檢測方法完全按試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度的白藜蘆醇對果蠅壽命的影響 對照組和白藜蘆、低、中、高劑量組果蠅的半數(shù)死亡時間分別為52、55、59及62 d；對照組和白藜蘆醇低、中、高劑量組的壽命及最高壽命比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中高劑量組果蠅的壽命均顯著高于中、低劑量組及對照組(P<0.05)，而中劑量組顯著高于低劑量組與對照組(P<0.05)，低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)(表1-1、表1-2)。

表1-1 不同濃度的白藜蘆醇對果蠅壽命的影響 (d)

表1-2 不同濃度的白藜蘆醇對果蠅壽命影響的兩兩比較結(jié)果

2.2不同濃度的白藜蘆醇對正常小鼠抗氧化能力的影響 小鼠全血/血清標本來自于溴代苯造模前，其檢測的是白藜蘆醇對正常小鼠抗氧化能力的影響，此時模型組與空白對照組重復，因此本結(jié)果只比較空白對照組與3個給藥組。4組小鼠血中GSH-Px、SOD及MDA的水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中低劑量組的GSH-Px、SOD及MDA與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；中、高劑量組小鼠的GSH-Px與SOD水平顯著高于空白對照組，高劑量組MDA的水平顯著低于空白對照組(P<0.05)，中劑量組與空白對照組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。中劑量組小鼠GSH-Px、SOD及MDA的水平與低劑量組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而高劑量組與低劑量組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量組的GSH-Px及MDA與中劑量組比較有統(tǒng)計學意義，SOD比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2-1，表2-2)。

2.3不同濃度的白藜蘆醇對肝臟脂質(zhì)過氧化損傷模型小鼠抗氧化能力的影響 溴代苯造模后，與空白對照組相比，模型對照組小鼠肝臟GSH-Px和SOD水平降低，而MDA水平升高，提示造模成功。模型組及白藜蘆醇各劑量組肝臟GSH-Px、SOD及MDA比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中高、中、低劑量組GSH-Px、SOD及MDA與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中劑量組GSH-Px、SOD的水平與低劑量組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而MDA比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高劑量組的GSH-Px、SOD及MDA與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組的GSH-Px水平顯著高于中劑量組，肝組織MDA水平顯著低于中劑量組(P<0.05)，SOD的水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表3-1、表3-2)。

表2-1 不同濃度的白藜蘆醇對正常小鼠抗氧化能力的影響

表2-2 不同濃度的白藜蘆醇對正常小鼠

表3-1 不同濃度的白藜蘆醇對肝臟脂質(zhì)過氧化

表3-2 不同濃度的白藜蘆醇對肝臟脂質(zhì)過氧化損傷模型小鼠

4 討 論

近年來，白藜蘆醇在抗氧化方面的作用越來越引起研究人員的注意，通過研究其抗氧化作用機制對于防治心腦血管系統(tǒng)的氧化自由基損傷具有積極意義。

機體衰老是自然界的必然過程，現(xiàn)在比較公認的衰老的自由基學說是Harman[11]在1956年提出的，他認為機體的衰老主要與自由基的生成、機體本身對自由基的反應以及抗氧化失衡等有關。衰老過程中的退行性變是細胞正常代謝過程中產(chǎn)生的自由基的有害作用造成的，是機體組織細胞不斷產(chǎn)生的自由基積累的結(jié)果。隨著年齡增加，細胞內(nèi)有害物質(zhì)逐漸堆積。自由基是正常代謝的中間產(chǎn)物，其可使細胞內(nèi)的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，損害生物膜；還能夠使蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)，引起DNA損傷，影響其正常功能；細胞損傷后又會產(chǎn)生更多的有害物質(zhì)，使更多的細胞受損，從而形成一種惡性循環(huán)，最終導致機體死亡，壽命縮短[12]。由此推測，給予自由基抑制劑及抗氧化劑可以延緩細胞衰老、延長壽命。

白藜蘆醇主要是通過清除或抑制自由基的生成、調(diào)節(jié)與抗氧化有關的酶的活性等發(fā)揮抗氧化作用。白藜蘆醇具有廣泛的抗氧化作用，能清除氧自由基，減輕氧化應激損傷。Zini等[13]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇(<0.1 mmol/L)能部分逆轉(zhuǎn)缺氧再通氧造成的呼吸控制率降低，且濃度依賴性地抑制細胞色素C釋放；1 nmol/L的白藜蘆醇可減少超氧陰離子的產(chǎn)生；0.1 mmol/L的白藜蘆醇還能部分保護缺氧再通造成的線粒體膜損傷。這些作用與白藜蘆醇所具有的抗氧化能力密不可分。本研究發(fā)現(xiàn)，添加不同濃度白藜蘆醇的培養(yǎng)液喂養(yǎng)的果蠅的平均壽命、平均最高壽命、半數(shù)死亡的時間較普通培養(yǎng)液喂養(yǎng)的都有所延長，并且隨著白藜蘆醇濃度的增高，所延長的時間越久。研究數(shù)據(jù)表明白藜蘆醇能夠濃度依賴性地延長果蠅壽命。同時，白藜蘆醇能夠提高脂質(zhì)過氧化損傷模型小鼠體內(nèi)的SOD、GSH-Px活性，降低體內(nèi)MDA水平，提示白藜蘆醇可增加模型小鼠抗氧化酶活力，減少過氧化損傷。說明白藜蘆醇能夠保護并增強機體抗氧化酶類的活性，抑制體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化，糾正機體自由基的代謝紊亂，維持機體氧化和抗氧化能力的平衡，對心腦血管起到保護作用，這也可能是其延長壽命的機制之一。

白藜蘆醇可提高機體抗氧化酶活性，同時降低脂質(zhì)過氧化損傷，這可能是其濃度依賴性延長果蠅壽命的機制之一。白藜蘆醇的抗氧化作用和清除自由基的作用與人體多種疾病的關系密切，本研究僅就白藜蘆醇對壽命的影響和抗氧化的機制進行初步研究，其具體作用機制還有待進一步完善研究與探索。

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