陜北地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因的RT-PCR檢測(cè)及其序列分析

馮光惠，杜虎平，李夏隆，亢福仁

(榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000)

馬鈴薯病毒家族成員包括X病毒(PVX)、Y病毒(PVY)、A病毒(PVA)、S病毒(PVS)、卷葉病毒(PLRV)等，其中PVX是馬鈴薯病毒家族成員的典型類型。攜帶X病毒的馬鈴薯植株通常不表現(xiàn)出癥狀，但感染X病毒可導(dǎo)致植株葉片失綠、變小和塊莖壞死病變等。PVX與PVY和PVA復(fù)合感染可導(dǎo)致更嚴(yán)重的癥狀，由此造成的馬鈴薯產(chǎn)量損失超過(guò)任何單獨(dú)病毒侵染。X病毒主要靠汁液接觸傳播，也可以通過(guò)昆蟲(chóng)咀嚼式口器機(jī)械傳播，除馬鈴薯外，煙草、辣椒、番茄也會(huì)成為X病毒的寄主[1]。

由于馬鈴薯是無(wú)性繁殖作物，隨著脫毒種薯種植代(年)數(shù)的增加，病毒在植株體內(nèi)不斷積累以及在植物間互相傳播，導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)逐漸下降，而且還會(huì)使馬鈴薯感染其他種類的病毒和類病毒。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)田間種植馬鈴薯的帶毒情況，采用莖尖剝離脫毒法、超低溫療法[2-3]等脫毒技術(shù)控制病毒的蔓延，可為脫毒馬鈴薯的推廣種植奠定基礎(chǔ)。

檢測(cè)馬鈴薯病毒最常用的方法有雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)、反轉(zhuǎn)錄PCR法(RT-PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。DAS-ELISA法操作簡(jiǎn)單、直觀、實(shí)用性強(qiáng)，準(zhǔn)確度較高，但檢測(cè)病毒含量較低的馬鈴薯時(shí)，靈敏度和準(zhǔn)確度不高，會(huì)出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。而RT-PCR檢測(cè)技術(shù)即使在馬鈴薯病毒含量極低時(shí)也可以快速檢測(cè)出來(lái)，該方法具有靈敏、快速、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于馬鈴薯及其他植物病毒的檢測(cè)[4-6]。在RT-PCR檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上，研究人員應(yīng)用多重RT-PCR對(duì)馬鈴薯多種病毒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，如Nie等[7]檢測(cè)了馬鈴薯PVX、PVY、PVA、PVS、PLRV 5種病毒和1種紡錘類病毒(PSTVd)；王中康等[8]、董代幸等[9]分別同時(shí)檢測(cè)了馬鈴薯PVX、PVS、PVY、PLRV以及PVX、PVA、PVY、PLRV 4種病毒。隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，Bright等[10]利用該方法檢測(cè)了馬鈴薯PVX、PVY、PVA和PLRV 4種病毒；Sheila 等[11]采用該方法同時(shí)檢測(cè)了PVX、PVS、番茄斑萎病毒(TSWV)和PLRV 4種病毒。多重RT-PCR法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法極大地提高了馬鈴薯病毒的檢測(cè)效率，并逐漸應(yīng)用到其他植物、動(dòng)物病毒以及微生物的檢測(cè)上，但多重RT-PCR法和熒光定量PCR法易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，Gambino等[12]、牛建新等[13]在利用多重RT-PCR檢測(cè)葡萄病毒時(shí)也有類似報(bào)道。國(guó)內(nèi)研究者采用RT-PCR方法檢測(cè)了不同地區(qū)的馬鈴薯X病毒[14-16]，但尚未見(jiàn)用RT-PCR法檢測(cè)和分析陜北地區(qū)馬鈴薯PVX的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以陜北8個(gè)縣(區(qū))種植2～3代的疑似攜帶病毒馬鈴薯為研究對(duì)象，采用RT-PCR方法檢測(cè)該地區(qū)的馬鈴薯PVX，并對(duì)PVX的外殼蛋白(Coat protein，CP)基因序列進(jìn)行分析，明確病毒的變異程度，以期為脫毒馬鈴薯的推廣種植提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品的采集 于2013-07-10在馬鈴薯生長(zhǎng)盛期至成熟期，采集疑似攜帶病毒馬鈴薯植株的葉片，于常溫下保存于保濕組織培養(yǎng)瓶中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后于4 ℃冰箱保存。馬鈴薯樣品信息見(jiàn)表1。

1.1.2 儀器與試劑 主要儀器有PCR儀(朗基，杭州)及電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，意大利)。Trizol試劑及cDNA合成試劑盒、DNA膠回收試劑盒、pGEM-Teasy載體、TaqDNA聚合酶、dNTP、10×buffer均購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的PVX CP基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，上游引物為5′-ACAGGCC-ACAGGGTCAACTAC-3′，下游引物為5′-CATCT-AGGCTGGCAAAGTCGT-3′。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為620 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，將其用滅菌TE (pH 8.0)稀釋至濃度為10 μmol/L。

1.2 方 法

1.2.1 馬鈴薯X病毒的RT-PCR檢測(cè) 1)總RNA的提取。采用Trizol法，參照文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行，略做改動(dòng)。具體步驟是：稱取0.1 g馬鈴薯葉片在研缽中用液氮研磨，取1.5 mL離心管加入1 mL Trizol液，將研磨液與Trizol液混合均勻；4 ℃、12 000 r/min離心15 min；轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入0.2 mL氯仿，渦旋混勻，室溫放置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液(水相)于另一離心管中，按上清液體積分別加入1/2體積的異戊醇、0.8 mol/L檸檬酸鈉和1.2 mol/L氯化鈉，混合均勻，室溫放置5～10 min，4 ℃、12 000 r/min離心8 min，棄上清液，將沉淀用1 mL 體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌2次，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，小心倒掉乙醇，室溫自然干燥后溶于用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過(guò)的ddH2O，于-80 ℃條件下保存。

表 1 供試馬鈴薯樣品的信息

2) cDNA的合成。按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書操作，對(duì)提取的馬鈴薯葉片總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。具體反應(yīng)體系如下：馬鈴薯總RNA 5 μL，Anchored Oligo(dT)18(0.5 μg/μL) 1 μL，2×ES Reaction Mix 10 μL，EasyScriptRTEnzyme Mix 1 μL，加RNase-free Water至20 μL。混勻后，水浴鍋中42 ℃孵育30 min，在PCR儀中于85 ℃條件下加熱失活5 min。

3) PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系：cDNA 3 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，10×buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取6 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL Loading Buffer混勻，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，于凝膠成像系統(tǒng)中照相。

1.2.2 CP基因的克隆及序列測(cè)定 用DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，將其與pGEM-Teasy載體連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，在加有IPTG和X-gal的LB平板上篩選白色菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將含目的條帶的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 CP基因序列分析 用DNAstar軟件分析CP基因的序列相似性，用Clustalx 1.83和Mega 5.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。在GenBank中搜索國(guó)內(nèi)外12個(gè)不同地區(qū)(表2)的馬鈴薯X病毒CP基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析陜北馬鈴薯X病毒的來(lái)源及不同地區(qū)陜北馬鈴薯X病毒CP基因變異程度。

表 2 國(guó)內(nèi)外12個(gè)不同地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因序列的信息

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯X病毒CP基因的RT-PCR檢測(cè)

對(duì)采自陜北8個(gè)縣(區(qū))的馬鈴薯葉片cDNA的PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，均能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為620 bp左右的目的條帶，表明這些馬鈴薯植株均感染了X病毒。但不同縣(區(qū))樣品PCR產(chǎn)物的電泳條帶亮度不一，其中，宜川縣丹川鎮(zhèn)(7泳道)樣品的PCR產(chǎn)物條帶最亮，神木縣爾林兔鎮(zhèn)(1泳道)、榆陽(yáng)區(qū)馬合鎮(zhèn)(2泳道)樣品PCR產(chǎn)物條帶亮度次之，其他5個(gè)縣(區(qū))樣品PCR產(chǎn)物條帶亮度較淡。可能是由于提取的樣品總RNA品質(zhì)不同，導(dǎo)致PCR體系中cDNA品質(zhì)有差異所致。

圖 1 馬鈴薯X病毒CP基因的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 馬鈴薯X病毒CP基因序列的分析

將X01～X08 8個(gè)馬鈴薯X病毒CP基因片段提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的GenBank登錄號(hào)分別為KJ620839、KJ620840、KJ620841、KJ620842、KJ620843、KJ620844、KJ620845、KJ620846。用DNAstar軟件比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，8個(gè)CP基因序列之間均有不同程度的差異，其(G+C)含量在50.0%～51.29%，故從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索(G+C)含量在49.58%～51.96%的其他12個(gè)地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因，進(jìn)行序列一致性分析，結(jié)果表明，本研究中的8個(gè)CP基因序列一致性較高，其中X02(榆陽(yáng)區(qū))與X03(定邊縣)樣品CP基因一致性最低，為95.2%；X01(神木縣)與X02(榆陽(yáng)區(qū))樣品CP基因一致性最高，為99.4%；來(lái)自陜北8個(gè)縣(區(qū))樣品與從GenBank中搜索的國(guó)內(nèi)外其他12個(gè)地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因的一致性為92.9%～98.5%。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)顯示，陜北8個(gè)縣(區(qū))馬鈴薯X病毒CP基因的系統(tǒng)進(jìn)化來(lái)源相似，雖聚為一個(gè)大類，但又分為2個(gè)區(qū)，其中，子長(zhǎng)縣、寶塔區(qū)、定邊縣和志丹縣X病毒的CP基因序列分在Ⅰ區(qū)，與阿根廷、加拿大及我國(guó)黑龍江CP基因分在同一個(gè)區(qū)；神木縣、榆陽(yáng)區(qū)、綏德縣和宜川縣X病毒的CP基因序列分在Ⅱ區(qū)，同時(shí)北京CP基因分在該區(qū)。就地理位置而言，Ⅰ區(qū)的陜北4個(gè)采樣地主要分布在東北方向，靠近內(nèi)蒙古和山西；而Ⅱ區(qū)的陜北4個(gè)采樣地分布在西南方向，與甘肅和寧夏毗鄰。我國(guó)新疆、寧夏與印度、美國(guó)的CP基因序列來(lái)源相似，同分在Ⅲ區(qū)；我國(guó)福建與澳大利亞的CP基因序列相似，我國(guó)貴州與英國(guó)的CP基因序列相似，以上4個(gè)CP基因同分在Ⅳ區(qū)。

3 討 論

本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，陜北8個(gè)縣(區(qū))最近幾年都在推廣種植脫毒馬鈴薯，但一級(jí)脫毒種薯種植2～3年后，馬鈴薯葉片開(kāi)始出現(xiàn)花葉、皺縮等癥狀，薯塊性狀發(fā)生變化，產(chǎn)量也呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明X病毒或其他病毒可能在馬鈴薯體內(nèi)存在。究其原因，一是地方檢疫部門對(duì)馬鈴薯脫毒苗及各級(jí)種薯的檢驗(yàn)檢疫監(jiān)督不嚴(yán)，造成將帶毒種薯發(fā)放給農(nóng)民種植；二是大部分農(nóng)戶分散種植馬鈴薯，且馬鈴薯與其他作物倒茬輪作種植，在倒茬種植時(shí)，原有茄科植物如西紅柿、辣椒等感染的各種病毒，會(huì)由機(jī)械或汁液傳播感染馬鈴薯。

圖 2 陜北及國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

RT-PCR分子檢測(cè)技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)馬鈴薯的攜帶病毒情況，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍的病毒檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)的應(yīng)用對(duì)脫毒馬鈴薯種薯的推廣及馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。筆者認(rèn)為，采用RT-PCR法檢測(cè)病毒時(shí)，只要提取的馬鈴薯總RNA品質(zhì)高，設(shè)計(jì)不同的特異引物，就能擴(kuò)增出預(yù)期的目的條帶，不會(huì)發(fā)生假陰性現(xiàn)象，檢測(cè)效果好。另外，在用RT-PCR法檢測(cè)常見(jiàn)的PVX、PVY、PVS、PVA、PVM和PLRV 6種病毒以及類病毒PSTVd時(shí)，可通過(guò)改變PCR反應(yīng)體系中的溫度，從而在PCR儀中實(shí)現(xiàn)多種病毒的同步檢測(cè)。

馬鈴薯X病毒CP基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，本研究中的陜北8個(gè)縣(區(qū))馬鈴薯X病毒CP基因的序列一致性為95.2%～99.4%，與國(guó)內(nèi)外12個(gè)不同地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因序列的一致性在92.9%～98.5%。曲靜等[18]發(fā)現(xiàn)，山東馬鈴薯X病毒分離物與GenBank中15個(gè)有代表性的X病毒株系或分離物的CP基因序列的一致性在80.1%～99.7%；張威等[19]發(fā)現(xiàn)，黑龍江馬鈴薯X病毒分離物與GenBank中17個(gè)X病毒分離物的CP基因序列一致性在75.5%～99.2%；姚東校等[20]發(fā)現(xiàn)，貴州馬鈴薯X病毒分離物與19個(gè)不同地區(qū)X病毒分離物的CP基因序列一致性在78.6%～97.5%。本研究中，陜北馬鈴薯X病毒CP基因與其他12個(gè)地區(qū)CP基因序列一致性較高，可能是因?yàn)殛儽钡貐^(qū)近幾年引入馬鈴薯品種較多，引種時(shí)間較短所致。這與Kawakami等[21]、Robertson等[22]對(duì)馬鈴薯X病毒CP基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果一致。總之，陜北地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因存在一定程度的變異，但其系統(tǒng)進(jìn)化來(lái)源相似，聚為一個(gè)大類。主要是引種速度較快、引入品種較多所致。由于采集地和土壤性質(zhì)不同，有關(guān)引進(jìn)品種、機(jī)械操作方式和種植年代不同引起的馬鈴薯X病毒CP基因序列變異，還有待進(jìn)一步研究。

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