醋酸鉛對小鼠的急性毒性效應

孫相和，寧紅梅，李 沖，陳玲麗，孔令蕓，葛亞明

(河南科技學院 動物科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

鉛(Lead，Pb)是一種多親和性有毒重金屬，在日常生活中被廣泛應用于工農業(yè)生產中。雖然鉛及其化合物在工農業(yè)生產中發(fā)揮著重要作用，但會對人和動物體產生毒害作用。誤食含鉛物質或者吸入鉛及其化合物，都可引起鉛中毒，其對機體各系統(tǒng)均能造成嚴重損傷[1-2]。有研究表明，鉛對兒童智力和生長發(fā)育危害嚴重，特別對記憶能力的損害尤為明顯[3]。鉛毒性持久，半衰期長，不易排出體外，在動物體內容易富集，人食用鉛富集動物的肉類產品會對人體產生不利影響。鉛不是動物體生長必需的元素，且可對動物體產生累積性毒害作用[4]。因此，動物體內理想狀態(tài)下鉛含量應為零[5]。

目前，鉛的廣泛應用使人和動物的生活環(huán)境受到其嚴重污染[6-7]，并已嚴重威脅人類和動物的健康。有調查顯示，鉛在職業(yè)性慢性中毒中排行首位[8]。鉛對兒童大腦功能的損傷效應往往是長期且不可逆的[9-10]，其對神經系統(tǒng)血腦屏障的損害使得兒童和幼齡動物產生認知缺陷[11]。另外，鉛對動物免疫和生殖方面的損害也得到越來越多的關注[12-14]。然而，關于鉛中毒對動物體整體損害的研究尚未見報道。為此，本研究進行了對小鼠灌胃醋酸鉛的急性毒性試驗，以評價醋酸鉛對小鼠的急性毒性效應，為深入研究鉛的毒性作用機制、明確鉛毒性作用的靶器官、提高人類對鉛毒性的認識提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 昆明種健康小鼠164只，4周齡，雌雄各半，由河南新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供。小鼠每籠飼養(yǎng)5只，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(24±2) ℃，相對濕度42%～57%。

1.1.2 試劑與儀器 醋酸鉛[(CH3COO)2Pb·3H2O]，分析純，購自天津市恒興化學試劑制造有限公司，批號：20120413，使用時用去離子水配制成不同濃度。電子天平，購自賽多利斯科學儀器有限公司；Leica RM 2235輪轉式切片機，購自Leica Microsystems Nussloch GmbH；Leica DMIL LED顯微鏡及其照相系統(tǒng)，購自徠卡顯微系統(tǒng)貿易有限公司。

1.2 方 法

試驗前對小鼠進行為期1周的適應性飼養(yǎng)觀察，觀察期內小鼠自由采食、飲水和活動。

1.2.1 醋酸鉛半數致死劑量(LD50)的測定 預試驗：將小鼠隨機分為6組，每組4只，雌雄各半，各組醋酸鉛劑量分別為1 000，2 000，4 000，8 000，16 000和32 000 mg/kg，以小鼠平均體質量計算，按20 mL/kg 劑量灌胃給藥，觀察臨床癥狀并記錄死亡情況，判斷0致死量的醋酸鉛劑量(LD0)和全數致死量的醋酸鉛劑量(LD100)。根據給藥劑量，按公式i=(LD100-LD0)/(n-1)確定正式分組劑量公比r的對數i，并計算出劑量公比r=lg-1i，其中n為預分組數。

正式試驗：據預試驗得出的結果，將小鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，按給藥劑量由低到高分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組，按1/r等比稀釋法配制等比濃度醋酸鉛溶液，按20 mL/kg劑量灌胃給藥，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組醋酸鉛的灌胃劑量分別為4 033.7，5 762.4，8 232.0，11 760.0，16 800.0，24 000.0 mg/kg，統(tǒng)計36 h內小鼠的死亡情況。利用Bliss法計算LD50及其95%可信限。

1.2.2 醋酸鉛對小鼠體質量及臟器指數的影響 將小鼠進行隨機分組，共分4組，每組20只，雌雄各半，根據攻毒劑量依次分為對照組、低鉛組、中鉛組和高鉛組，各組分別飲用醋酸鉛濃度為0，2.4，4.8和9.6 mmol/L的去離子水[15]，飲毒時間9 d。分別于自由飲水染毒后0和9 d測定試驗小鼠體質量，記為初始體質量和終末體質量，并記錄體質量變化程度。試驗結束時(10 d)，統(tǒng)計存活的小鼠數，采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖觀察后取出各臟器，用吸水紙吸去污血，稱取各臟器的質量，以臟器質量/100 g體質量的比值表示各臟器指數。

1.2.3 醋酸鉛對小鼠臟器影響的病理組織學檢查 對觀察期內死亡的小鼠進行剖檢，并在試驗結束時，對全部存活小鼠進行解剖檢查，解剖檢查前24 h禁食不禁水，檢查組織器官是否存在明顯病理變化。同時采集小鼠的大腦、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟組織，固定在體積分數10%中性福爾馬林溶液中，并將組織脫水、包埋、切片、常規(guī)HE染色，進行病理組織學檢查，以考察醋酸鉛對各內臟器官的急性毒性效應。

1.3 數據處理

試驗數據采用“平均值±標準差”表示，應用SPSS 17.0和Excel 2003軟件對數據進行統(tǒng)計分析[16]。

2 結果與分析

2.1 醋酸鉛對小鼠的半數致死劑量(LD50)

預試驗初步確定0致死和全數致死量的醋酸鉛劑量分別為4 000和24 000 mg/kg，i=0.156，r=1.43，1/r=0.7，據此醋酸鉛溶液的灌胃劑量由高到低依次為24 000.0 mg/kg劑量組(Ⅵ組)、16 800.0 mg/kg劑量組(Ⅴ組)、11 760 .0 mg/kg劑量組(Ⅳ組)、8 232.0 mg/kg劑量組(Ⅲ組)、5 762.4 mg/kg劑量組(Ⅱ組)和4 033.7 mg/kg劑量組(Ⅰ組)。

急性毒性試驗中，灌胃后1 h小鼠開始出現(xiàn)死亡，36 h內小鼠死亡情況見表1。利用Bliss法計算醋酸鉛經口灌胃LD50的回歸方程為y=-15.328+5.052 1lgx，其中y為醋酸鉛對小鼠的致死概率，x為醋酸鉛灌胃劑量的常用對數值，半數致死劑量LD50=10 562 mg/kg，LD5095%的可信限是8 609.4～3 023 mg/kg (Feiller校正)，LD5=4 990.6 mg/kg，LD95=22 353 mg/kg。

表 1 不同劑量醋酸鉛灌胃36 h內小鼠的死亡情況(n=10)

2.2 醋酸鉛對小鼠體質量和臟器指數的影響

醋酸鉛對小鼠體質量、臟器指數的影響見表2和表3。由表2可知，各組間小鼠初始體質量差異不顯著(P>0.05)，隨著試驗過程中對醋酸鉛飲用量的增加，個別小鼠發(fā)生應激性死亡，試驗結束時，各組間小鼠的終末體質量差異不顯著(P>0.05)。對照組和中鉛組小鼠終末體質量與初始體質量差異極顯著(P<0.01)，高鉛組小鼠終末體質量與初始體質量差異顯著(P<0.05)，低鉛組小鼠的終末體質量與初始體質量差異不顯著(P>0.05)。各組間小鼠終末體質量與初始體質量的變化差異也不顯著(P>0.05)。

表 2 醋酸鉛對小鼠體質量的影響(n=20)

表 3 醋酸鉛對小鼠臟器指數的影響

由表3可知，小鼠大腦指數隨著醋酸鉛劑量的增加呈降低趨勢，小鼠心臟指數、脾臟指數和腎臟指數隨醋酸鉛劑量的增加總體呈升高趨勢，肺臟指數和肝臟指數的變化無規(guī)律性。與對照組相比，低鉛組小鼠腎臟指數顯著升高(P<0.05)，中鉛組和高鉛組小鼠腎臟指數極顯著升高(P<0.01)；醋酸鉛處理組與對照組其他臟器指數的差異均不顯著(P>0.05)。

2.3 醋酸鉛處理小鼠臟器的病理剖檢

對觀察期內死亡小鼠進行剖檢，并在試驗結束時，對全部存活小鼠進行剖檢，觀察小鼠的病理組織學變化，結果見圖1。

圖 1 醋酸鉛處理小鼠的病理組織學變化 (×400)

2.3.1 一般剖檢變化 與對照組相比，染毒組小鼠精神沉郁，反應遲鈍，行動緩慢。飲用醋酸鉛1 d后，低鉛組小鼠死亡1只，剖檢觀察各組織器官無明顯變化，與對照組小鼠組織器官相似；高鉛組小鼠分別在飲用醋酸鉛第6天和第8天共死亡3只，死亡小鼠心臟腫脹，脾臟有出血現(xiàn)象且體積增大，腎臟明顯腫大且質地變軟，大腦、肺和肝臟剖檢變化不明顯。與對照組相比，染毒組小鼠心臟、脾臟和腎臟體積均有不同程度的增大，其中高鉛組小鼠心臟、脾臟和腎臟體積增大較明顯，其他組織器官剖檢變化不明顯。

2.3.2 病理組織學變化 由圖1可見，對照組小鼠大腦、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟組織無異常變化。隨著醋酸鉛劑量的增加，染毒小鼠大腦皮層顆粒細胞數量減少，神經纖維萎縮斷裂，并有纏結現(xiàn)象(圖1-A4)；心肌纖維間隙擴張，肌纖維出現(xiàn)斷裂(圖1-B4)；高鉛組小鼠肺泡變化明顯，肺泡壁有聚集粘連現(xiàn)象(圖1-C4)，其他組與對照組無明顯差別；肝臟小葉結構紊亂，肝索排列混亂且有斷裂現(xiàn)象，竇狀隙擴張，肝細胞大小不均勻，細胞有空泡化現(xiàn)象(圖1-D4)；隨著醋酸鉛劑量的增加，小鼠脾臟出血現(xiàn)象逐漸明顯，紅髓白髓界限不明顯，巨噬細胞數量減少(圖1-E4)；腎臟近曲小管管腔收縮，致密斑數量增加，刷狀緣不明顯(圖1-F4)。

3 討 論

半數致死劑量(LD50)是指在規(guī)定時間內，通過特定感染途徑，使某種試驗動物半數死亡所需化學物質的最小劑量，是描述化學物質毒性強弱的常用指標。目前可以采用很多方法計算LD50，但Bliss法最為準確。本試驗利用Bliss法軟件計算醋酸鉛[(CH3COO)2Pb·3H2O]的LD50為10 562 mg/kg，95%可信區(qū)間為8 609.4～3 023 mg/kg，依據《我國工業(yè)化學物急性毒性分級標準》[17]，該物質為低毒。

體質量是反映機體發(fā)育是否正常的標志。本試驗結果表明，在醋酸鉛急性染毒期間，小鼠體質量變化與染毒情況關系不明顯，并沒有隨著染毒劑量的增加而發(fā)生顯著變化。臟器指數是反映實驗動物器官功能是否正常的重要指標，在毒理學試驗中可依據化學物質對臟器的影響初步判斷其毒性。本試驗中，隨著醋酸鉛劑量的增加，小鼠心臟指數、脾臟指數和腎臟指數總體升高，其中以腎臟指數升高趨勢最顯著；大腦指數則降低，而肺臟指數和肝臟指數的變化無明顯規(guī)律性。

大量研究表明，鉛對動物體的損害是全身性的，其能損害多種組織和器官[18-20]。本試驗中，醋酸鉛急性染毒后，剖檢小鼠的心臟、脾臟和腎臟有腫大充血現(xiàn)象，其他組織器官剖檢變化不明顯；病理組織學分析表明，小鼠大腦、心臟、肺、肝臟、脾臟和腎臟均有病變發(fā)生，其中只有高鉛組小鼠肺組織有明顯病理變化，而低鉛組和中鉛組小鼠肺無病理變化，推測消化道染毒對小鼠肺的毒性效應可能存在一定的制約性。本試驗結果進一步驗證了鉛對動物多組織、多器官均有損傷作用，這為以后研究鉛對機體整體損傷提供了依據。

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