小鼠cofilin-1基因及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建與體內(nèi)外表達(dá)

李玲玲，張 偉，杜 蕊，宋玲珍，柴學(xué)軍，胡新德，陳樹(shù)林，趙善廷

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 Institute of Anatomy and Cell Biology,University of Freiburg,Freiburg 79104,Germany)

運(yùn)動(dòng)是生命細(xì)胞的基本特征之一。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞而言，其運(yùn)動(dòng)能力離不開(kāi)肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白以及一些調(diào)節(jié)蛋白對(duì)微絲和微管的調(diào)節(jié)作用。肌動(dòng)蛋白解聚因子(Actin depolymerizing factor，ADF)/Cofilin家系成員之一的絲切蛋白(Cofilin)，是普遍存在于真核生物中的一種低分子質(zhì)量的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，它通過(guò)結(jié)合和剪切F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)，改變F-actin骨架結(jié)構(gòu)，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng)的功能，在細(xì)胞趨化、遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1-4]。Cofilin的活性通過(guò)磷酸化、去磷酸化、磷酸肌醇化、pH改變等方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中磷酸化與去磷酸化是Cofilin響應(yīng)胞內(nèi)外刺激信號(hào)改變最重要的調(diào)節(jié)方式。Cofilin失活可引發(fā)多種疾病，如癌癥、阿爾茲海默癥、局部缺血性腎病等[5]。

哺乳動(dòng)物cofilin基因有2種亞型：cofilin-1和cofilin-2，分別編碼不同的蛋白。cofilin-1 (cfl1)在多種非肌肉組織中表達(dá)，特別是在腦和肝臟中；而cofilin-2主要在肌肉組織中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，ADF-/-敲除小鼠胚胎可以成活[6]，并完成正常的胚胎發(fā)育，而cfl1-/-敲除小鼠胚胎不能正常成活，胚胎于9.5 d死亡[7]。cfl1-/-腦特異性敲除小鼠的大腦皮層細(xì)胞遷移和細(xì)胞周期均受到影響，表明在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的遷移離不開(kāi)cfl1的調(diào)節(jié)作用[8]。

研究表明，Cofilin N端第3位絲氨酸磷酸化后，使Cofilin無(wú)法與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，失去解聚功能[9]；相反，p-Cofilin去磷酸化使Cofilin活化[10]。第3位絲氨酸突變?yōu)镾3A可使Cofilin不被磷酸化，始終處于活化狀態(tài)；S3E或S3D的突變則使Cofilin類(lèi)磷酸化，Cofilin始終保持失活狀態(tài)[11]。

體外試驗(yàn)表明，Cofilin過(guò)表達(dá)[12-13]或Cofilin Ser 3位點(diǎn)點(diǎn)突變可引起細(xì)胞運(yùn)動(dòng)障礙[14- 15]，但Cofilin-1 (Cfl1)及其Ser 3位點(diǎn)磷酸化在神經(jīng)元遷移中的作用機(jī)制仍不清楚。為了進(jìn)一步研究Cfl1在神經(jīng)元遷移中的作用機(jī)制，本試驗(yàn)以小鼠的cfl1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，經(jīng)點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建Cfl1的野生型、持續(xù)活化型和持續(xù)失活型真核表達(dá)載體，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和mRNA半定量檢測(cè),體外觀察其表達(dá)情況，并利用活體原位電轉(zhuǎn)的方法在雞胚脊髓神經(jīng)元中檢測(cè)其表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

昆白系小鼠，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；種雞蛋購(gòu)自陜西楊凌種雞廠；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5α、克隆載體pEASY-T1 Simple、Trans2K DNA Marker、Trans5K DNA Marker，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自Promega公司；Platinum?TaqDNA Polymerase High Fidelity、M-MLV cDNA合成試劑盒、LipofectamineTM2000、Trizol試劑、Rabbit-anti-GFP、Donkey-anti-rabbit-488、Goat-anti-mouse-568，均購(gòu)自Invitrogen Life Technologies；胎牛血清，購(gòu)自Hyclone公司；D-MEM/F-12、Opti-MEM，購(gòu)自Gibco公司；TRITC-conjugated Phalloidin、DAPI，購(gòu)自Millipore公司；Anti-Myc Tag Monoclonal Antibody，購(gòu)自Santa Cruz公司。CHO細(xì)胞系、pCAG-MCS-myc和pCAG-EGFP載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；引物合成(PAGE純化方式)及測(cè)序工作由生工生物(上海)有限公司完成。

1.2 小鼠cfl1基因的克隆與分析

1.2.1 小鼠cfl1基因的克隆 根據(jù)小鼠cfl1基因的CDS區(qū)序列(GenBank序列號(hào)NM_007687)，用DNAMan軟件設(shè)計(jì)包括整個(gè)基因閱讀框的特異性引物F/P1和R/P1(表1)。取成年小鼠大腦組織提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR StarMix 10 μL，F(xiàn)/P1 0.75 μL，R/P1 0.75 μL，cDNA 5 μg，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；68 ℃后延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，與pEASY-T1 Simple載體于室溫下連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，經(jīng)菌液PCR、酶切及測(cè)序鑒定后保留陽(yáng)性克隆，將其命名為pEASY-T1-cfl1。

表 1 試驗(yàn)用所引物及其序列

1.2.2 不同物種cfl1基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 通過(guò)NCBI(Bethesda，MD,USA,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公共數(shù)據(jù)庫(kù)查找不同物種Cofilin蛋白的氨基酸序列，并利用UniPro (http://www.uniprot.org/)獲得氨基酸序列的主要結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵位點(diǎn)信息，通過(guò)DNAman version 5.2.2 (Lynnon Biosoft Company，USA)進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

1.3 cfl1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用經(jīng)引物引入點(diǎn)突變的方法，參考靶基因cfl1的閱讀框，用DNAMan軟件設(shè)計(jì)3條上游引物，依次為F/P2、F/P3、F/P4(表1)，分別用于野生型、活化型和失活型Cfl1 3種真核表達(dá)載體的構(gòu)建。F/P2、F/P3、F/P4 3條上游引物的5′端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，同時(shí)加保護(hù)性堿基(Kozak序列)以增強(qiáng)目的片段的轉(zhuǎn)錄；下游引物為公用的R/P，其5′端引入BglⅡ酶切位點(diǎn)，同時(shí)補(bǔ)加堿基以防止移碼突變。以1.2.1節(jié)構(gòu)建的質(zhì)粒pEASY-T1-cfl1為模板，利用高保真聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用EcoRⅠ和BglⅡ?qū)厥盏哪康钠魏驼婧吮磉_(dá)載體pCAG-MCS-myc雙酶切，回收的目的條帶經(jīng)T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pCAG-cfl1(wt)-myc(pCAG-cfl1-wt)、pCAG-cfl1(S3A)-myc(pCAG-cfl1-S3A)和pCAG-cfl1(S3D)-myc(pCAG-cfl1-S3D)3種真核表達(dá)載體(圖1)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，經(jīng)菌液PCR、EcoRⅠ/BglⅡ雙酶切及測(cè)序鑒定后保留相應(yīng)陽(yáng)性克隆。

1.4 小鼠cfl1在細(xì)胞中表達(dá)的半定量分析

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將CHO細(xì)胞接種到含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和青鏈霉素 (100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素)的DMEM/F12((DMEM與F12體積比為1∶1)培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～90%時(shí)，參照LipofectamineTM2000的使用說(shuō)明，用pCAG-MCS-myc、pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常CHO細(xì)胞作為對(duì)照(Control)。

1.4.2 Cfl1 mRNA表達(dá)量的半定量RT-PRC分析 將真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)24 h后提取總RNA，備用。設(shè)計(jì)半定量引物F/P5和R/P5(表1)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)能力。以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，反應(yīng)體系為：總RNA 2.5 μg，5×Reaction Buffer 4 μL,OligodT 2 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，RT-Enzmye 1 μL，用DEPC水補(bǔ)足20 μL體系。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×TaqPCR StarMix 10 μL，F(xiàn)/P5 0.75 μL，R/P5 0.75 μL，cDNA 5 μg，用ddH2O補(bǔ)足25 μL體系。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；68 ℃后延伸5 min。取PCR產(chǎn)物20 μL進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

圖 1 pCAG-cfl1-myc真核表達(dá)載體的構(gòu)建原理

1.4.3 細(xì)胞爬片的免疫熒光染色 制備CHO細(xì)胞爬片，待細(xì)胞融合度達(dá)到25%～40%時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM2000使用說(shuō)明用pCAG-cfl1的3種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，24 h后，爬片經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定、體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100透化、體積分?jǐn)?shù)1% BSA封閉，各步間漂洗用0.1 mol/L PBS。F-actin經(jīng)TRITC-conjugated Phalloidin (體積比1∶4 000)室溫染色2 h，經(jīng)PBS漂洗后，用DAPI (體積比1∶500)標(biāo)記細(xì)胞核。用抗熒光淬滅劑(Dako)將漂洗后的爬片固定在載玻片上，晾干后置于結(jié)構(gòu)照明顯微鏡Axio Observer Z1(蔡司)下，觀察重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.5 小鼠cfl1基因在雞胚脊髓中的表達(dá)

1.5.1 pCAG-cfl1的雞胚活體原位電轉(zhuǎn) 在37 ℃、相對(duì)濕度65%條件下對(duì)種蛋進(jìn)行孵化，在胚胎發(fā)育第3天(E3)取出雞胚，側(cè)面開(kāi)直徑2～3 cm大小的孔，在體視顯微鏡下，使用毛細(xì)管注射針將pCAG-cfl1的3種質(zhì)粒分別與pCAG-EGFP按4∶1體積比配制的工作液0.1～0.5 μL準(zhǔn)確注射到脊髓腔，將針狀電極置脊椎兩側(cè)，確保電極與組織之間有一定空隙，使用BTX ECM830電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)電壓18 V，每次電擊60 ms，間隔100 ms，電脈沖6次，整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌操作工作臺(tái)內(nèi)完成，以pCAG-EGFP轉(zhuǎn)染脊髓作為對(duì)照(Control)。轉(zhuǎn)染后3 d取出，在顯微鏡下觀察結(jié)果，電轉(zhuǎn)部位呈現(xiàn)綠色熒光者(綠色熒光蛋白GFP的顏色)視為陽(yáng)性。

1.5.2 雞胚切片的制備 在倒置體視顯微鏡下觀察陽(yáng)性表達(dá)的胚胎。在倒置體視顯微鏡下，用尖頭鑷子劃破卵黃膜，取出整個(gè)胚胎，轉(zhuǎn)移至4 ℃多聚甲醛中，在搖床上固定3 d，取出組織，吸干液體，用40 g/L瓊脂糖包埋， 注意方向，頭朝上，確定好位置，在Leica全自動(dòng)振蕩切片機(jī)上連續(xù)切片，切片厚度為80 μm，置于含體積分?jǐn)?shù)0.1% NaN3的0.1 mol/L 磷酸緩沖液(PB)中于4 ℃下保存。

1.5.3 組織切片的免疫熒光染色 將組織切片從4 ℃冰箱中取出，用0.1 mol/L PB漂洗3次，用Anti-Myc Tag Monoclonal Antibody、Rabbit-anti-GFP 4 ℃過(guò)夜孵育組織切片，PB漂洗后，分別用Donkey-anti-rabbit-488、Goat-anti-mouse-568 4 ℃過(guò)夜孵育。經(jīng)PB漂洗后，用DAPI(體積比1∶500)標(biāo)記細(xì)胞核。用抗熒光淬滅劑(Dako)將漂洗后的組織切片固定在載玻片上，晾干后置于結(jié)構(gòu)照明顯微鏡Axio Observer Z1下，觀察重組質(zhì)粒在神經(jīng)元中的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

將轉(zhuǎn)染后的組織切片經(jīng)免疫熒光染色后，在結(jié)構(gòu)照明顯微鏡Axio Observer Z1下拍照。在照片中熒光較強(qiáng)的部位選取200 μm×200 μm大小的面積，通過(guò)ImgeJ對(duì)轉(zhuǎn)染神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。利用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同物種Cfl1蛋白的氨基酸序列比對(duì)

小鼠Cfl1蛋白是由166個(gè)氨基酸編碼的蛋白質(zhì)。氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖 2 不同物種Cofilin-1 (Cfl1)蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

圖2顯示，小鼠與人類(lèi)Cfl1蛋白的氨基酸序列同源性為98.8%，與原雞的Cfl1蛋白的氨基酸序列同源性為81.3%，與非洲爪蟾Cfl1蛋白的氨基酸序列同源性為77.3%。不同物種的Cfl1蛋白肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的結(jié)合區(qū)域相似度較高，關(guān)鍵區(qū)域的保守性較高，如與Cfl1磷酸化狀態(tài)相關(guān)的S3位點(diǎn)以及核定位信號(hào) K30-K34等。

2.2 cfl1基因重組真核表達(dá)載體的鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得cfl1的CDS序列，構(gòu)建出pEASY-T1-cfl1重組克隆質(zhì)粒。以構(gòu)建的pEASY-T1-cfl1重組克隆質(zhì)粒為模板，利用加有酶切位點(diǎn)和特定位點(diǎn)點(diǎn)突變的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得cfl1的不同突變體(Cfl1-wt、Cfl1-S3A、Cfl1-S3D)，其經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大約520 bp的片段(圖3-A)，與預(yù)期條帶大小相符。用EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切回收產(chǎn)物和pCAG-MCS-myc，依次構(gòu)建真核重組表達(dá)載體pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D，限制性酶切產(chǎn)物中均出現(xiàn)了5 200 bp左右的載體骨架和500 bp左右的插入片段(圖3-B)，與預(yù)期結(jié)果一致。真核重組表達(dá)載體的測(cè)序結(jié)果顯示，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了Cfl1野生型的表達(dá)載體pCAG-cfl1-wt及Cfl1的磷酸化及去磷酸化突變載體pCAG-cfl1-S3D和pCAG-cfl1-S3A。野生型Cfl1的第3個(gè)氨基酸是絲氨酸(S)，密碼子是UCU；Cfl1的類(lèi)磷酸化突變體第3位是天冬氨酸(D)，密碼子是GAU；Cfl1的去磷酸化突變體第3位是丙氨酸(A)，密碼子是GCU(圖3-C)。

圖 3 cfl1基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建與區(qū)分

2.3 cfl1基因重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞24 h后，提取總RNA，利用半定量RT-PCR檢測(cè)構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)的強(qiáng)弱。由圖4-A可以看出，對(duì)照組細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體pCAG-MCS-myc的Cfl1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異；處理組pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D的Cfl1 mRNA表達(dá)均比轉(zhuǎn)染pCAG-MCS-myc的細(xì)胞強(qiáng)。采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)采集到的灰度值進(jìn)行分析，其結(jié)果與半定量RT-PCR結(jié)果一致。由圖4-B可知，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的CHO細(xì)胞中，Cfl1 mRNA表達(dá)量較對(duì)照明顯升高，說(shuō)明轉(zhuǎn)染的能夠表達(dá)Cfl1的質(zhì)粒正確表達(dá)了Cfl1蛋白；同時(shí)，轉(zhuǎn)染pCAG-cfl1-wt與pCAG-cfl1-S3A的CHO細(xì)胞對(duì)Cfl1 mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異，而轉(zhuǎn)染pCAG-cfl1-S3D的CHO細(xì)胞對(duì)Cfl1 mRNA的表達(dá)較pCAG-cfl1-wt和pCAG-cfl1-S3A明顯增強(qiáng)。

將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的CHO細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光染色，用Anti-Myc Tag Monoclonal Antibody對(duì)重組質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行標(biāo)記，觀察到重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中可正常表達(dá)，且融合蛋白的表達(dá)量較高(圖4-C)。

圖 4 cfl1基因重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中的表達(dá)

用TRITC-conjugated Phalloidin對(duì)F-actin進(jìn)行標(biāo)記，正常CHO細(xì)胞呈不規(guī)則形，胞體較大，胞漿豐富，輪廓清楚，細(xì)胞核卵圓形，位于胞質(zhì)中央，細(xì)胞密集時(shí)呈長(zhǎng)梭形，無(wú)偽足或偽足較少，細(xì)胞稀疏時(shí)伸出偽足，標(biāo)記的F-actin位于細(xì)胞質(zhì)及偽足中(圖5-a，b)。在轉(zhuǎn)染pCAG-cfl1-wt的CHO細(xì)胞中，偽足均勻分布在細(xì)胞周?chē)?，且F-actin較長(zhǎng)(圖5-c)；在標(biāo)記myc后，可觀察到重組質(zhì)粒所表達(dá)的融合蛋白分散在細(xì)胞核周?chē)掖嬖邳c(diǎn)狀分布，在細(xì)胞周?chē)膫巫阒芯蟹植?，大部分與F-actin重合[16](圖5-d)。在轉(zhuǎn)染pCAG-cfl1-S3A的細(xì)胞中，可觀察到細(xì)胞周?chē)奈⒔z呈簇狀分布(圖5-e)，且分布位置集中在融合蛋白表達(dá)較強(qiáng)的部位(圖5-f)；而在轉(zhuǎn)染pCAG-cfl1-S3D的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的微絲分布無(wú)明顯變化(圖5-g,h)，其對(duì)肌動(dòng)蛋白的影響有待進(jìn)一步研究。

圖 5 Cfl1超表達(dá)對(duì)CHO細(xì)胞肌動(dòng)蛋白(F-actin)的影響

2.4 cfl1基因重組質(zhì)粒在雞胚脊髓中的表達(dá)檢測(cè)

對(duì)采集的GFP陽(yáng)性材料進(jìn)行切片，在體視顯微鏡下挑出綠色熒光表達(dá)較強(qiáng)的切片進(jìn)行免疫熒光染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果均檢測(cè)到了構(gòu)建質(zhì)粒的表達(dá)(圖6-A)，其中對(duì)照組熒光染色圖為轉(zhuǎn)染等濃度pCAG-EGFP的雞胚脊髓圖。為了驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒在神經(jīng)元中表達(dá)的高效性，利用ImgeJ對(duì)所選區(qū)域目的質(zhì)粒表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，t檢驗(yàn)結(jié)果表明，在所選取的相同面積內(nèi)，pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D與等濃度GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的個(gè)數(shù)無(wú)明顯差異 (圖6-B)，證明了重組質(zhì)粒在神經(jīng)元中表達(dá)的高效性。

3 討 論

Cofilin是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的肌動(dòng)蛋白解聚因子。在小鼠胚胎發(fā)育第10天(E10)，cfl1開(kāi)始在神經(jīng)管中表達(dá)，從胚胎發(fā)育第13天(E13)開(kāi)始，cfl1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，一直維持到小鼠出生，然后有所下降[7-8]，而胚胎發(fā)育第13天至小鼠出生正是大腦神經(jīng)元產(chǎn)生和遷移的時(shí)期，這表明cfl1與神經(jīng)元遷移有著密切的關(guān)系。cfl1基因敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育嚴(yán)重異常，所有胚胎都在胚胎發(fā)育中后期死亡(E10～E19)，胚胎發(fā)育障礙的主要表現(xiàn)之一是神經(jīng)管未閉合，神經(jīng)系統(tǒng)不能發(fā)育[17]，表明cfl1對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。

圖 6 cfl1基因重組質(zhì)粒在雞胚脊髓神經(jīng)元中的表達(dá)

然而，cfl1在體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)中的研究相對(duì)困難，導(dǎo)致了cfl1在神經(jīng)元遷移中的作用機(jī)制尚不明確。為此，筆者在試驗(yàn)中采用了活體原位電轉(zhuǎn)基因技術(shù)。它能夠?qū)⒅亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)入神經(jīng)元中，是體內(nèi)研究功能基因的有效方法之一。在電轉(zhuǎn)過(guò)程中，由于質(zhì)粒帶負(fù)電荷使其向正極方向移動(dòng)，可瞬時(shí)進(jìn)入細(xì)胞，利用表達(dá)載體自身的系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成，能夠很直觀地檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況以及對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的影響。該方法為進(jìn)一步研究Cofilin-1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)神經(jīng)元遷移的影響提供了技術(shù)保障。

此外，Cofilin是普遍存在于真核細(xì)胞的一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，當(dāng)外源轉(zhuǎn)染能夠表達(dá)Cofilin的重組質(zhì)粒時(shí)，必須保證能夠有效地區(qū)分內(nèi)、外源Cofilin。因此，本試驗(yàn)中使用了帶有常規(guī)抗原標(biāo)簽c-Myc的真核表達(dá)載體pCAG-MCS-myc作為載體骨架。c-Myc是一種常用的短肽標(biāo)簽，不僅有利于對(duì)重組蛋白檢測(cè)，而且不會(huì)影響目的蛋白的理化性質(zhì)[18]。根據(jù)這一點(diǎn)，經(jīng)免疫熒光染色即可區(qū)分外源表達(dá)的Cofilin蛋白。

經(jīng)過(guò)CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染和雞胚脊髓電擊轉(zhuǎn)染的檢測(cè)，證明本研究所構(gòu)建的pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D 3種真核表達(dá)載體在體外和體內(nèi)都能夠高效表達(dá)，為進(jìn)一步探討Cofilin-1對(duì)神經(jīng)元的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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