3種單增李斯特氏菌快速檢測方法的比較

周 陽 ，祝長青，郭桂萍，徐幸蓮，徐寶才，薛建麗，蔣 原，楊 軍，郭云昌，劉秀梅，付瑞燕

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽省食品安全分析與檢測省級實驗室，安徽 合肥230000；2 江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京210001；3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；4 江蘇雨潤食品產(chǎn)業(yè)集團有限公司，江蘇 南京210041；5 南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院,江蘇 南京 210028；6 國家食品安全風險評估中心，北京100022)

單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一種重要的人畜共患病致病菌，主要污染肉類、乳制品和蔬菜等，從20世紀90年代起被世界衛(wèi)生組織列為最重要的食源性病原菌之一[1-3]。LM對環(huán)境的耐受性很強，具有耐鹽、耐低溫的特點，在冷藏溫度下仍然可以大量繁殖，引起動物和人類流產(chǎn)、敗血癥、腦膜炎等疾病[4-7]。近年來，多次發(fā)生由LM引起的食源性疾病暴發(fā)并造成部分患者死亡，因此引起了世界各國的高度關(guān)注[8-9]。

目前，LM的檢驗仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法為主，這種方法操作繁瑣，耗時長，不能實現(xiàn)快速篩檢[10-11]。在此情況下，基于免疫學(xué)與分子生物學(xué)的快速檢測技術(shù)得以迅速發(fā)展，對食源性致病菌的檢測起到了重要作用。本試驗選取RapidChek?李斯特菌蛋白條、CPA恒溫擴增法[12-13]和實時熒光PCR方法[14]檢測樣品中的LM，以篩選適用于不同條件且快速有效、實用性強的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料 單增李斯特氏菌標準菌株CMCC 54004，由江蘇出入境檢驗檢疫局購自中國醫(yī)學(xué)細菌菌種保藏管理中心。供檢新鮮樣品鹽水鴨、涼拌菜各200 g，購自超市。

1.1.2 培養(yǎng)基 單增李斯特氏菌增菌肉湯LB1和LB2(北京陸橋)，胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA，美國OXOID)，胰蛋白胨大豆營養(yǎng)肉湯(TSB，美國OXOID)，PALCAM瓊脂(美國OXOID)，李斯特顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉)。

1.1.3 試 劑 蛋白酶K(20 mg/mL)，無水乙醇，細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱)(Cat.#DP302，天根公司)，RapidChek?李斯特菌檢測試劑盒(產(chǎn)品編號 7000171)，李斯特菌核酸檢測試劑盒(恒溫擴增-試紙條法)(杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司)，單增李斯特氏菌實時熒光PCR檢測試劑盒(上海輝睿生物科技有限公司，Cat.#BD-I-303)。

1.1.4 儀 器 恒溫振蕩金屬浴(博日MB-102)、高速離心機(Thermo Scientific Biofuge Stratos)、常規(guī)PCR儀(Eppendorf 5331/5332 Gene Genies)、實時熒光PCR擴增儀(Roche LightCycler 480Ⅱ)和電動移液器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 陰性樣品的確認 按照國家食品安全標準GB 4789.30-2010[15]對供檢的鹽水鴨、涼拌菜樣品進行增菌，然后利用實時熒光PCR方法對增菌液進行快速篩選，同時涂布PALCAM瓊脂和李斯特顯色培養(yǎng)基平板進行菌落分離，選取檢測結(jié)果為陰性的樣品用于后期人工布菌試驗。

1.2.2 陰性樣品增菌培養(yǎng)及LM標準菌株增菌液的制備 為了對3種快速檢測方法進行比較，需要對1.2.1中得到的陰性樣品進行增菌培養(yǎng)，然后與LM標準菌株純培養(yǎng)物的梯度稀釋液混合，制備檢測樣本。具體操作如下：將陰性樣品用LB1增菌肉湯進行增菌，(30±1) ℃培養(yǎng)24 h；從LB1增菌后的菌液中吸取1 mL至盛有100 mL LB2增菌肉湯的錐形瓶中，(30±1) ℃培養(yǎng)24 h，得到樣品增菌液；同時，用胰蛋白胨大豆營養(yǎng)肉湯對標準菌株CMCC 54004進行增菌，(37±1) ℃培養(yǎng)24 h，獲得LM標準菌株增菌液。

1.2.3 LM標準菌株梯度稀釋液的制備及樣品布菌 對標準菌株CMCC 54004的增菌液進行10倍梯度稀釋(增菌液在稀釋前用振蕩器將菌懸液充分振勻)，將100～107倍稀釋的菌液按照每管100 μL分裝至1.5 mL的離心管中，每個稀釋度準備6份備用。為了解標準菌株純培養(yǎng)物的生長情況，吸取100 μL 10-5～10-7梯度的稀釋菌液(涂布前必須將其各自充分混勻)均勻涂布于胰蛋白大豆瓊脂(TSA)上，每個梯度涂布3塊平板，(37±1) ℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)，取平均值。

取1.2.2中的樣品增菌液900 μL至1.5 mL離心管中，然后加入100 μL標準菌株純培養(yǎng)物的各梯度稀釋液(分裝前陰性樣品增菌液和標準菌株增菌液均需充分混勻)，得到混合菌液，振蕩混勻，12 000g離心10 min，棄上清，備用。

1.2.4 核酸提取 取3份1.2.3中制備的混合菌液，利用細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱)提取核酸備用，具體操作步驟按照產(chǎn)品說明書進行。

1.2.5 蛋白條檢測 取3份混合菌液，用400 μL生理鹽水懸浮沉淀，沸水浴10 min，冷卻至室溫，然后用蛋白檢測試紙條進行快速檢測，以無菌水作陰性對照，以標準菌株純培養(yǎng)物作陽性對照，具體操作見說明書。

1.2.6 CPA恒溫擴增法[12-13]檢測 取出裝有玻璃化試劑的反應(yīng)管，每管加入15 μL復(fù)溶緩沖液(包括dNTP、Mg2+、PCR反應(yīng)預(yù)混液等)，然后滴加20 μL的石蠟油，室溫靜置2～3 min以促進玻璃化試劑的充分溶解。此后，按照試劑盒說明書操作，并設(shè)置陰、陽性對照(陰性對照加入4 μL無菌水，陽性對照加4 μL標準菌株純培養(yǎng)物)。將反應(yīng)管置于常規(guī)PCR儀或恒溫儀上，63 ℃ 反應(yīng)45 min，將擴增后的反應(yīng)管放入固定盒中，合上固定盒后將其裝入裝置外盒，在15～30 min觀察并記錄檢測結(jié)果，30 min后判讀結(jié)果無效。觀察3次平行試驗的檢測結(jié)果，拍照記錄試驗結(jié)果。

1.2.7 實時熒光PCR方法[14]檢測 選用LM實時熒光PCR檢測試劑盒對提取的核酸進行檢測評估?？偡磻?yīng)體系25 μL：包括12.5 μL LM PCR反應(yīng)液Ⅰ(主要包括PCR反應(yīng)預(yù)混液、dNTP、Mg2+等)，4 μL LM PCR反應(yīng)液Ⅱ(主要包括引物、探針)，3.5 μL滅菌蒸餾水，5.0 μL DNA模板(以無菌水作陰性對照，以標準菌株純培養(yǎng)物作陽性對照)。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，58 ℃復(fù)性45 s，收集熒光信號，50個循環(huán)；40 ℃冷卻40 s。將3次平行試驗反應(yīng)結(jié)束后的Ct值取平均值，并進行結(jié)果分析。

1.2.8 傳統(tǒng)平板分離方法檢測 利用LM顯色平板將標準菌株梯度稀釋液以及1.2.3中得到的混合菌液分別劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，每個平板挑取5個可疑菌落，利用實時熒光PCR進行快速檢測，同時在TSA培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h后進行生化鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 LM標準菌株的平板計數(shù)

平板計數(shù)結(jié)果顯示，100 μL 經(jīng)107倍稀釋后的LM菌液平板計數(shù)的平均值為5，所對應(yīng)的細菌數(shù)量級為100；經(jīng)106倍稀釋后的菌液平板計數(shù)的平均值為44，所對應(yīng)的細菌數(shù)量級為101；經(jīng)105倍稀釋后的菌液平板計數(shù)的平均值為453，所對應(yīng)的細菌數(shù)量級為102。依此類推，經(jīng)104、103、102、101、100倍稀釋后對應(yīng)的細菌數(shù)量級分別為103、104、105、106、107。

2.2 LM的蛋白條檢測

不同樣品中LM的蛋白條檢測結(jié)果見圖1。

圖 1 不同樣品中單增李斯特氏菌的蛋白條檢測結(jié)果

由圖1可知，LM蛋白檢測試紙條的質(zhì)控線(即C線)正常，表明檢測結(jié)果可靠。在LM純菌增菌液、鹽水鴨和涼拌菜基質(zhì)中的最低檢測限為10-1，即菌體數(shù)量級在106時檢測線(即T線)明顯，可檢測出食品中的LM。該法操作簡單，只需通過觀察質(zhì)控線和檢測線即可判定結(jié)果，但檢測靈敏度太低。

2.3 LM的CPA恒溫擴增檢測

由圖2可知，CPA恒溫擴增快速檢測試紙條的質(zhì)控線(即C線)正常，表明檢測結(jié)果可信。在純菌增菌液中該方法的檢測限為10-3，即當菌體數(shù)量級為104時檢測線(即T線)明顯，此時可檢測出食品中的LM；在鹽水鴨和涼拌菜基質(zhì)中，檢測限為10-2，略低于純菌，說明食品基質(zhì)中不同成分對LM的CPA恒溫擴增法存在一定干擾，但影響程度很小，在實際檢測工作中的實用性較強。

圖 2 不同樣品中單增李斯特氏菌的CPA恒溫擴增檢測結(jié)果

2.4 LM的實時熒光PCR檢測

由圖3可知，經(jīng)過天根離心柱法提取核酸后進行實時熒光PCR檢測，陰性、陽性對照正常，擴增曲線典型。由表1可見，純菌增菌液與2種食品基質(zhì)的檢測結(jié)果類似，檢測靈敏度相同，最低檢測限為10-6(即菌體數(shù)量級為101)時仍可檢出食品中的LM，檢測靈敏度高，結(jié)果準確，非常適合對含有少量LM樣品的檢測。

2.5 3種LM快速檢測方法的比較與驗證

由以上結(jié)果可知，利用實時熒光PCR方法檢測LM的靈敏度最高，當增菌液中僅含有幾十個目標菌時便可通過該方法檢測出來，因此可以利用該方法對大量的檢測樣品進行初步篩選，然后利用傳統(tǒng)方法進行試驗結(jié)果的驗證，從而進一步提高檢測的準確性和檢測效率；其次是CPA恒溫擴增法，該方法的操作步驟相對簡單，不需要熒光PCR儀等大型儀器，比較適合基層實驗室；靈敏度最低的是蛋白條檢測法，該方法的操作步驟最為簡單，無需進行細菌核酸的提取，也不需要大型的儀器，只需要進行煮沸即可進行目標菌的檢測，但是當菌體含量較低時會影響檢測結(jié)果的準確性。通過傳統(tǒng)平板分離方法對檢測結(jié)果進行驗證，結(jié)果顯示，試驗中的樣品增菌液在菌體數(shù)量級達到104時可以通過顯色平板劃線培養(yǎng)分離到LM，從而進一步證實了以上3種檢測方法的可行性。

3 結(jié)論與討論

目前，在LM的快速檢測方法中，免疫學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法應(yīng)用較為廣泛。由于ELISA法操作繁瑣，檢測過程耗時長，因此本試驗選取了LM蛋白條檢測法；分子生物學(xué)檢測方法選取了CPA恒溫擴增法和實時熒光PCR方法。

圖 3 不同樣品中單增李斯特氏菌的實時熒光PCR檢測結(jié)果

本試驗通過比較3種快速檢測方法發(fā)現(xiàn)，蛋白條檢測法雖然操作簡單，但容易受到菌體數(shù)量以及檢測蛋白種類的影響，檢測靈敏度低，在實際樣品檢測中應(yīng)用性差；CPA恒溫擴增法僅需具備恒溫功能的相關(guān)儀器就可以進行PCR反應(yīng)，操作簡單，既克服了蛋白條檢測靈敏度低的缺點，又不需要先進的實驗儀器，降低了實驗成本，縮短了檢測周期，提高了檢測效率，其中玻璃化DNA聚合酶保存技術(shù)實現(xiàn)了試劑盒的常溫運輸，密閉的一次性核酸檢測裝置有效地避免了擴增產(chǎn)物氣溶膠擴散造成的污染和假陽性，可以通過檢測試紙條直接對檢測結(jié)果進行判讀，比較適合基層實驗室應(yīng)用；實時熒光PCR方法的特異性好，檢測靈敏度高，最低檢測限可達到幾十個菌，同時還避免了常規(guī)PCR必需的電泳過程，縮短了檢測周期，極大地降低了交叉污染的風險，能較好地完成實際樣品的檢測，但操作比較繁瑣，對實驗條件、儀器及實驗人員的操作水平要求較高，適用于實驗條件比較優(yōu)越的實驗室。

表 1 不同樣品中單增李斯特氏菌檢測的實時熒光PCR反應(yīng)的Ct值

本試驗結(jié)果表明，CPA恒溫擴增法和實時熒光PCR方法檢測效果較好，周期短，檢測效率高。同時通過與傳統(tǒng)平板分離鑒定方法的對比，證實了2種快速檢測方法的可行性，為不同水平的實驗室進行檢測提供了較好的選擇，在實際檢測中可以將快速檢測方法與傳統(tǒng)方法進行有機結(jié)合，構(gòu)建比較完備的檢測體系，從而極大地提高檢測效率。

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