濃縮蘋果汁中高滲酵母的分離鑒定及耐糖性研究

劉燦燦，岳田利，袁亞宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

高滲酵母是指能夠在較高滲透壓環(huán)境(高糖或高鹽)中較好地生長的酵母菌。根據(jù)國內(nèi)外的報(bào)道，高滲酵母主要存在于接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等[1]。目前，高滲酵母菌因其在食品工業(yè)以及生物工程方面的應(yīng)用引起人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注[2-7]。此外，由于高滲酵母菌的細(xì)胞壁厚及細(xì)胞質(zhì)中含耐滲透壓的成分[8-10]，傳統(tǒng)的巴氏殺菌很難將其完全殺滅，因此高滲酵母嚴(yán)重威脅了食品工業(yè)的質(zhì)量安全。近年來，高滲酵母導(dǎo)致的國際貿(mào)易受阻現(xiàn)象迅速增多，大規(guī)模退貨、索賠現(xiàn)象屢屢發(fā)生，對(duì)中國蘋果汁產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)和聲譽(yù)產(chǎn)生了不良影響[11-13]。針對(duì)中國濃縮蘋果汁行業(yè)所面臨的高滲酵母污染問題，急需采取應(yīng)對(duì)措施。因此，明確引起濃縮蘋果汁腐敗的高滲酵母菌株，并了解其生物學(xué)和遺傳學(xué)特性，已成為實(shí)現(xiàn)高滲酵母快速檢測(cè)及控制的關(guān)鍵，而這方面的研究還較少。為此，本研究以陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司提供的腐敗濃縮蘋果汁為材料，進(jìn)行了高滲酵母的分離、篩選和純化，并對(duì)分離菌株的形態(tài)學(xué)、生理與生化特性，以及耐糖性、厭氧性、產(chǎn)氣性進(jìn)行研究，以期為濃縮蘋果汁中高滲酵母的控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

腐敗濃縮蘋果汁由陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母粉10.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

高糖瓊脂培養(yǎng)基[14]：酵母粉 10.0 g，葡萄糖 500.0 g，NaCl 0.1 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

麥?zhǔn)螹eclary培養(yǎng)基：酵母膏2.5 g，葡萄糖 1.0 g，醋酸鈉8.2 g，KCl 1.8 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 儀器與設(shè)備

BCN-1360B 生物潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器設(shè)備制造有限公司生產(chǎn)；CX31顯微鏡，奧林巴斯公司生產(chǎn)；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司生產(chǎn)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；DPX-G002B-1電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；JA2003型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；PH211 pH計(jì)，意大利Hanna Instruments公司生產(chǎn)；PTC-200型PCR儀，美國MJ Research公司生產(chǎn)；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)；Dolphin-doc凝膠成像系統(tǒng)，美國Wealtec公司生產(chǎn)；KYC 100B搖床，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.4 方 法

1.4.1 菌株的分離 將梯度稀釋10-5，10-6，10-7的濃縮蘋果汁分別涂布接種于含有0.1 g/L氨芐青霉素的YPD平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)。每個(gè)梯度3個(gè)平行，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d。

1.4.2 菌株的純化與培養(yǎng) 當(dāng)分離菌株在YPD培養(yǎng)基上進(jìn)入生長旺盛期時(shí)，挑取不同形態(tài)的酵母菌菌株，在YPD培養(yǎng)基上做平板劃線純化，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d。按此方法連續(xù)劃線直至單個(gè)平板上為形態(tài)單一的菌落時(shí)，挑取平板上的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

對(duì)樣品中分離到的單菌落進(jìn)行涂片，經(jīng)復(fù)紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)和純度。將含有雜菌的分離菌株用劃線分離法再次進(jìn)行純化，將純化后的菌株于4 ℃保存。

1.4.3 高滲酵母菌株的篩選 (1)耐高糖性檢驗(yàn)。挑取平板上純化的單菌落，在高糖瓊脂培養(yǎng)基上做平板劃線，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，觀察酵母菌的生長情況，能在葡萄糖質(zhì)量濃度為500 g/L的高滲條件下生長的酵母菌菌株為高滲酵母。

(2)形態(tài)學(xué)觀察。將高滲酵母在YPD固體培養(yǎng)基上劃線，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d，觀察菌落形狀、顏色、是否濕潤、是否光滑、邊緣是否整齊等特征。用美藍(lán)進(jìn)行簡單染色后于顯微鏡下觀察，記錄高滲酵母的無性繁殖方式、細(xì)胞的形狀和大小。將活化好的高滲酵母在麥?zhǔn)螹eclary培養(yǎng)基上劃線接種，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，鏡檢是否有子囊孢子。將活化好的高滲酵母在PDA平板上劃線接種(每個(gè)平板2～3條)，在菌線上蓋上無菌蓋玻片，28 ℃下培養(yǎng)3～7 d，顯微鏡下觀察是否有假菌絲生成。

(3)生理學(xué)特性。為了預(yù)測(cè)溫度、pH 值和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長的影響，將菌株在液體YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，作為種子液。取1 mL種子液接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，分別考察溫度(20，25，30，35，40 ℃)、pH值(2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 )及搖床轉(zhuǎn)速(90，120，150，180，210 r/min)對(duì)菌體生長的影響。培養(yǎng)24 h后于波長600 nm處測(cè)定菌體吸光度(OD600)，獲得最佳菌體培養(yǎng)條件。在最適溫度、pH值和搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)菌株，每隔2 h測(cè)定1次OD600，共培養(yǎng)24 h，繪制菌株生長曲線。

(4)生化特性。參照文獻(xiàn)[15-17]的方法，對(duì)分離菌株進(jìn)行發(fā)酵糖試驗(yàn)、同化碳源試驗(yàn)、同化氮源試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、類淀粉化合物生成試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、37 ℃生長試驗(yàn)、無維生素生長測(cè)試試驗(yàn)。

1.4.4 高滲酵母菌株的ITS序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析 (1)模板的制備。挑取斜面保存的高滲酵母菌株于YPD液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)16～20 h，使菌液的OD600保持在1.0左右，取分離株純培養(yǎng)物3 mL，按照D3370-01-E.Z.N.A.TMYeast DNA Kit酵母基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

(2)ITS區(qū)基因的PCR擴(kuò)增。采用PCR擴(kuò)增ITS序列時(shí)，所有試劑由Fungi Identification PCR Kit(50次量)(寶生物工程(大連)有限公司)提供。所用引物為Forward Primer和Reverse Primer，其中Forward Primer序列為:5′-CGCCAGGGTTTT-CCCAGTCACGAC-3′，Reverse Primer序列為:5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。PCR反應(yīng)體系為50 μL：模板DNA 10 μL，PCR Premix 25 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，dH2O補(bǔ)足50 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和回收。PCR擴(kuò)增完成后，采用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增的DNA片段，在UVP凝膠成像分析系統(tǒng)下切下目的條帶，采用凝膠回收試劑盒(離心柱型)回收純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。然后將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京三博遠(yuǎn)志生物工程有限公司測(cè)序。

(4)ITS序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。將獲得的高滲酵母菌株ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的酵母ITS序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，找出與其相似性最高的菌株， 確定每株菌的生物學(xué)分類地位。將得到的高滲酵母菌株的ITS序列用Clustalx 1.8進(jìn)行多重序列比對(duì)后, 用系統(tǒng)發(fā)育軟件包Mega 4.0進(jìn)行多序列比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.4.5 高滲酵母菌株耐糖能力的測(cè)定 將分離的高滲酵母菌株種子液分別接種到葡萄糖質(zhì)量濃度分別為300，350，400，450，500，550，600，650，700 g/L的高糖液體培養(yǎng)基中，每處理3個(gè)平行，置于25 ℃下培養(yǎng)，分別在接種24，48，72，96，120，144，168 h后觀察發(fā)酵情況，測(cè)定菌體OD600，觀察不同葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)分離菌株生長的影響。

1.4.6 高滲酵母菌株厭氧性的測(cè)定 將分離的高滲酵母菌株種子液分別接種于YPD液體培養(yǎng)基以及葡萄糖質(zhì)量濃度分別為500，550，600，650，700 g/L 的高糖液體培養(yǎng)基中，每處理3個(gè)平行，用封口膜和保鮮膜將三角瓶瓶口密封，靜置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，每天觀察培養(yǎng)液的渾濁度，并與未接種的培養(yǎng)基進(jìn)行比較，觀察并記錄液體培養(yǎng)基的渾濁程度。

1.4.7 高滲酵母菌株產(chǎn)氣性的測(cè)定 將分離的高滲酵母菌株種子液，分別接種于裝有YPD液體培養(yǎng)基以及葡萄糖質(zhì)量濃度分別為500，550，600，650，700 g/L的高糖液體培養(yǎng)基的杜氏小管中，塞上硅膠塞，每個(gè)處理3個(gè)平行，靜置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，每天觀察杜氏發(fā)酵管內(nèi)的產(chǎn)氣情況，并記錄產(chǎn)氣量。

2 結(jié)果與分析

2.1 高滲酵母菌株的分離、純化及其耐高糖性檢驗(yàn)

通過分離與純化，從陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司提供的腐敗濃縮蘋果汁樣品中，得到了1株酵母菌株，將其命名為B-LCC-12-01。經(jīng)過耐高糖性檢驗(yàn)，該菌可在含500 g/L葡萄糖的高糖培養(yǎng)基上很好地生長，因此本試驗(yàn)分離得到的菌株為高滲酵母菌。

2.2 高滲酵母菌株的形態(tài)學(xué)特征

菌落特征：B-LCC-12-01在YPD培養(yǎng)基上呈圓形，乳白色，表面隆起、不光滑，呈蠟狀，菌半濕潤易挑取，邊緣整齊；在高糖培養(yǎng)基上呈圓形，乳白色，表面隆起，菌株表面較YPD培養(yǎng)基的干燥(圖1)。

顯微形態(tài)：B-LCC-12-01細(xì)胞呈橢圓形，長 3.0～6.0 μm，寬2.0～5.0 μm，出芽生殖，有1～4個(gè)子囊孢子，孢子呈卵圓形，有假菌絲生成(圖2)，與酵母的形態(tài)特征一致。

圖 1 高滲酵母菌株B-LCC-12-01的菌落特征

圖 2 高滲酵母菌株 B-LCC-12-01顯微觀察結(jié)果(10×100)

2.3 高滲酵母菌株的最適生長條件及生長曲線

由圖3可知，在20～40 ℃菌株B-LCC-12-01的 OD600呈先增加后降低趨勢(shì)，最適生長溫度為25 ℃，高于40 ℃未見生長。

圖 3 溫度對(duì)高滲酵母菌株B-LCC-12-01生長的影響

由圖4可知，菌株B-LCC-12-01在pH 2.0～3.0 時(shí)生長呈增加趨勢(shì)，之后隨著pH的增加，B-LCC-12-01的生長變化幅度較小，pH為7.0時(shí)，菌株B-LCC-12-01的OD600較高，故菌株B-LCC-12-01生長的pH值范圍較廣，最適生長pH 值為7.0。

由圖5可知，在搖床轉(zhuǎn)速為90～150 r/min時(shí)，菌株B-LCC-12-01的OD600呈增加趨勢(shì)；之后隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，B-LCC-12-01的OD600無明顯變化，可知最適搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。

綜上所述，在溫度25 ℃，pH值7.0和搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的最適培養(yǎng)條件下，菌株B-LCC-12-01在液體YPD培養(yǎng)基中的生長曲線如圖6所示。由圖6可知，菌株B-LCC-12-01在培養(yǎng)的4 h之前為調(diào)整期，4～12 h為對(duì)數(shù)生長期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長期，連續(xù)培養(yǎng)24 h未見菌株衰亡。

圖 5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)高滲酵母菌株B-LCC-12-01生長的影響

2.4 高滲酵母菌株的生化特性

菌株B-LCC-12-01的發(fā)酵糖試驗(yàn)結(jié)果見表1，同化碳源試驗(yàn)結(jié)果見表2，其他生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表1～3可知，菌株B-LCC-12-01 可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、果糖及可溶性淀粉等糖類，而不能發(fā)酵乳糖和甘露醇；菌株B-LCC-12-01可以利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、山梨醇、甘露醇、甘油和體積分?jǐn)?shù)3%乙醇作為碳源，而不能利用乳糖、肌醇、檸檬酸和可溶性淀粉作為碳源；菌株B-LCC-12-01可以利用硝酸鹽、硫酸銨和L-賴氨酸作為氮源，有類淀粉化合物生成，可以在無維生素的培養(yǎng)基上以及37 ℃條件下生長。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[15]將菌株B-LCC-12-01初步鑒定為異常畢赤酵母屬。

表 1 高滲酵母菌株B-LCC-12-01的發(fā)酵糖試驗(yàn)結(jié)果

表 2 高滲酵母菌株B-LCC-12-01的同化碳源試驗(yàn)結(jié)果

表 3 高滲酵母菌株B-LCC-12-01的其他生理生化特性測(cè)定結(jié)果

2.5 B-LCC-12-01系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及菌種鑒定

通過對(duì)菌株B-LCC-12-01的 ITS基因兩端序列的測(cè)定及拼接(647 bp)，根據(jù)Blast比對(duì)分析結(jié)果，選擇GenBank 中相關(guān)酵母菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，菌株B-LCC-12-01與異常畢赤酵母Pichiaanomala(EU380207.1)的ITS序列相似性最高，達(dá)到100%，可以判斷 B-LCC-12-01屬于異常畢赤酵母。這與形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定的結(jié)果相符合。

圖 7 基于ITS序列構(gòu)建的高滲酵母菌株B-LCC-12-01與其他酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 高滲酵母菌株的耐糖能力、厭氧性和產(chǎn)氣性

不同質(zhì)量濃度葡萄糖對(duì)高滲酵母菌株 B-LCC-12-01生長的影響見圖8。由圖8可知，在同一培養(yǎng)時(shí)間下，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增大，菌株B-LCC-12-01 的生長呈下降趨勢(shì)；在同一葡萄糖質(zhì)量濃度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌株B-LCC-12-01的生長呈增加趨勢(shì)；葡萄糖質(zhì)量濃度越高，菌株B-LCC-12-01生長速度越慢，延滯期越長?？梢姡咸烟琴|(zhì)量濃度越高，對(duì)菌株的抑制作用越明顯。菌株B-LCC-12-01能在葡萄糖質(zhì)量濃度為300～650 g/L條件下生長，在葡萄糖質(zhì)量濃度為700 g/L條件下不能生長，說明菌株B-LCC-12-01能耐受的最大葡萄糖質(zhì)量濃度為650 g/L。

圖 8 不同質(zhì)量濃度葡萄糖對(duì)高滲酵母菌株B-LCC-12-01生長的影響

由表4可知，在厭氧條件下，菌株B-LCC-12-01能夠在YPD液體培養(yǎng)基和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為500，550，600，650 g/L的高糖培養(yǎng)基中發(fā)酵，使液體培養(yǎng)基變渾濁；隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵的速度逐漸減慢，使液體培養(yǎng)基變渾濁的時(shí)間延長，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度高于650 g/L之后B-LCC-12-01不再發(fā)酵，這與耐糖能力的測(cè)定結(jié)果相符。

表 4 高滲酵母菌株B-LCC-12-01的厭氧性測(cè)定結(jié)果

由表5可知，菌株B-LCC-12-01在YPD液體培養(yǎng)基和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為500，550，600，650 g/L 的高糖培養(yǎng)基中能夠發(fā)酵產(chǎn)氣；隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增大，產(chǎn)氣速度和產(chǎn)氣能力逐漸減小，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到700 g/L時(shí)，B-LCC-12-01不產(chǎn)氣，說明在葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到700 g/L的高糖培養(yǎng)基中菌株B-LCC-12-01已不能生長，這也與耐糖能力測(cè)定結(jié)果相符。結(jié)果表明，菌株B-LCC-12-01可在高糖厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)氣，從而導(dǎo)致果汁脹罐，影響濃縮蘋果汁的品質(zhì)。

表 5 高滲酵母菌株B-LCC-12-01的產(chǎn)氣性測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究從腐敗的濃縮蘋果汁樣品中分離獲得1株高滲酵母，將其命名為B-LCC-12-01。根據(jù)菌落的形態(tài)特征及生理生化特征，將B-LCC-12-01初步判定為異常畢赤酵母；經(jīng) ITS序列比對(duì)，B-LCC-12-01與異常畢赤酵母(Pichiaanomala)相似性達(dá)到100%，可判斷其為異常畢赤酵母。經(jīng)過耐糖性分析，菌株B-LCC-12-01能耐受的最大葡萄糖質(zhì)量濃度為650 g/L。經(jīng)厭氧性和產(chǎn)氣性分析，在適宜的葡萄糖質(zhì)量濃度下，菌株B-LCC-12-01能在厭氧的環(huán)境下發(fā)酵產(chǎn)氣，導(dǎo)致脹罐，從而對(duì)濃縮蘋果汁的品質(zhì)產(chǎn)生影響。

國內(nèi)外對(duì)高滲酵母的研究主要是其在食品行業(yè)和生物工程中的應(yīng)用，以及尋找有效的控制方法控制高糖或高鹽食品中高滲酵母的含量[18-19]。我國對(duì)高滲酵母的研究相對(duì)較少。本研究從腐敗的濃縮蘋果汁中分離得到1株異常畢赤酵母類高滲酵母，這對(duì)了解濃縮蘋果汁中主要污染菌的種類有十分重要的意義。同時(shí)也說明，巴氏殺菌并不能將濃縮蘋果汁中的高滲酵母完全殺滅，高滲酵母是引起果汁腐敗的原因，殘留的高滲酵母會(huì)對(duì)果汁品質(zhì)造成嚴(yán)重威脅，是果汁生產(chǎn)廠家目前亟需解決的問題之一，因此目前的殺菌控制方法還需要進(jìn)一步加強(qiáng)。

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