山西霍山五角楓不同海拔種群遺傳多樣性研究

張翠琴， 林麗麗， 王祎玲

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 臨汾 041004)

五角楓(AcermonoMaxim)，隸屬于槭樹科(Aceraceae)槭屬(Acer)，為落葉喬木，生長旺盛，分布于東北、華北和長江流域各省[1]。在秋天因樹齡不同葉片呈現(xiàn)不同顏色，觀賞價值很高，而且凈化空氣的作用效果也好，已成為中國許多地區(qū)重要的街道種植植物和風(fēng)景林樹種[2]；同時樹體含水量大，枯枝落葉分解快，也是極好的防火樹種[3]；五角楓單寧具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛作用，抗凝血作用明顯，是治療抗腦血栓的新藥；五角楓油對腫瘤細(xì)胞有一定抑制作用，可促進(jìn)新組織生長[4]，有廣闊應(yīng)用前景。而五角楓種群現(xiàn)處于下降的趨勢，分布也較以前零散 ，在《中國物種紅色名錄》被列為“近危種”，因此，研究五角楓遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)十分迫切。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence—related amplified polymorphism，SRAP) 是由美國加州大學(xué)作物系Li 和Quiros博士于2001年開發(fā)出來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[5]。它克服了SSR(Simple amplified polymorphic DNA)位點較少、AFLP(Amplified fragment length polymorphism)成本高的缺點[6]，是簡單經(jīng)濟(jì)、有效可靠的分子標(biāo)記系統(tǒng)，已成功應(yīng)用于光核桃[6]、白花樹[7]、麥冬[8]、鴨茅[9]等植物的遺傳多樣性研究。

據(jù)姬志峰等[10]的山西霍山五角楓天然種群表型性狀研究發(fā)現(xiàn)：五角楓表型性狀多樣性較高，且各個性狀之間存在一定的遺傳變異。在不同種群中，高海拔種群的表型變異較豐富，其表型多樣性就相對較高，而低海拔變異較低，表型多樣性就貧乏。本文采用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)技術(shù)探討山西霍山不同海拔五角楓種群的遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)，揭示五角楓種群的遺傳變異，了解種群內(nèi)和種群間的變異大小，分析影響五角楓遺傳結(jié)構(gòu)的因素及其與生境因子的相互關(guān)系，為合理開發(fā)利用及保護(hù)五角楓資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

供試材料于2011年5月初采自山西霍山興唐寺，野外研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，五角楓在興唐寺分布于海拔1400 m至2200 m之間, 由于海拔1400 m位于五角楓分布的邊緣地段，個體稀疏且分布不集中，受人為干擾嚴(yán)重，根據(jù)五角楓所處的地理環(huán)境，從1550 m開始采集，每個采集樣地的海拔相隔約150 m，每個采集樣地作為一個種群處理，共采集到5個種群，分別標(biāo)記為種群1(1550 m)、2(1700 m)、3(1850 m)、4(2000 m)、5(2150 m)。為避免由于營養(yǎng)繁殖所致的同一株系基因型的重復(fù)采樣，植株間距不小于30 m，每個種群隨機(jī)選取20～30個個體，同時采集每個樣地的土壤樣品和地理信息(表1)。所采集的葉片用變色硅膠迅速干燥，帶回實驗室，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法

1.2.1DNA的提取與純度檢測

本文采用改良的2×CTAB法[11]提取五角楓基因組總DNA。

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA的完整性，并用紫外分光光度計測定OD260和OD280的值，計算其純度及濃度。

1.2.2PCR擴(kuò)增與引物篩選

表2 本文中所用SRAP引物序列

選用Li和Quriros[5]所報道的引物，從88對引物組合中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的11對引物組合(表2)，用于所有個體的DNA樣本的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用10 μL的反應(yīng)體系，并對不同退火溫度、PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)以及反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。最終確定PCR的反應(yīng)體系為10 μL：0.4 μL引物(0.2 μL Me+0.2 μL Em)，1 μL DNA模板，5 μL Mix，3.6 μL ddH2O，正反向引物均為0.2 μL(0.75 μmol/L)，每管加10 μL礦物油覆蓋?；驍U(kuò)增儀為PTC-100型，反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸90 s，共5個循環(huán)；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于12%的非變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳。電泳結(jié)束后用硝酸銀染色并照相。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜進(jìn)行位點統(tǒng)計，在相近遷移位置上以有條帶的記為1，無條帶的記為0，形成原始數(shù)據(jù)。應(yīng)用POPGENE(version 1.31)[12]軟件統(tǒng)計分析表征遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)的參數(shù)：平均每個位點的觀察等位基因數(shù)(Na，Observed number of alleles)、平均每個位點的有效等位基因有效數(shù)目(Ne，Effective number of alleles)、多態(tài)位點百分率(PPB，Percentage of polymorphic bands)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、Nei基因多樣性指數(shù)(h) 及基因流(Nm)。并運用MEAG4軟件進(jìn)[13]行UPGMA聚類分析種群間的遺傳關(guān)系；使用WINAMOVA(version 1.55)[14]進(jìn)行分子方差分析，計算遺傳變異在居群間和居群內(nèi)的分布及顯著水平及種群間的遺傳分化和種群間的遺傳距離；應(yīng)用SPSS17.0軟件對五角楓遺傳多樣性指數(shù)與地理梯度進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1SRAP標(biāo)記多態(tài)性及五角楓種群遺傳多樣性

11對引物共擴(kuò)增產(chǎn)生擴(kuò)增條帶88條，其中多態(tài)性條帶86.8條，多態(tài)性條帶比率為98.6% 。從SRAP擴(kuò)增條帶的數(shù)量來看， 每對引物組合擴(kuò)增出的總帶數(shù)在3～13之間，平均7.8條。各引物組合獲得的總帶數(shù)見表3，由表可以看出引物組合Me2/Em7擴(kuò)增的條帶數(shù)最多，上游引物Me2最多，下游引物Em8最多(圖1和表3)。

圖1 引物Me2/Em7的SRAP-PCR部分?jǐn)U增電泳圖

應(yīng)用POPGENE(version 1.31)[12]軟件統(tǒng)計分析表征遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)的參數(shù)，各項多樣性指數(shù)(表4)表明：觀察等位基因總數(shù)(Na)變動范圍為1.5568～1.8636，有效等位基因數(shù)(Ne)介于1.3387～1.5448之間；Nei基因多樣性指數(shù)(h)在0.1996～0.3163之間，平均為0.2373；Shannon多樣性指數(shù)(I)范圍為0.2995～0.4693，平均為0.3535五角楓種群多態(tài)位點百分率(PPB)在55.68%～86.36%之間波動，在物種水平上為98.86%，表明霍山五角楓種群具有較高的遺傳多樣性。

在遺傳多樣性的各項指標(biāo)中，均以種群4為最高(Na=1.8636、Ne=1.5448、h=0.3163、I=0.4693、PPB=86.36%)，種群5為最低(Na=1.5568、Ne=1.3387、h=0.2008、I=0.3000、PPB=55.65%)，五角楓種群的遺傳多樣性從低到高依次為：5<2<1<3<4。

通過與土壤因子的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表5)，五角楓的各個遺傳多樣性指數(shù)與土壤因子之間及海拔因子均無顯著或極顯著相關(guān)，說明五角楓的遺傳多樣性及其遺傳結(jié)夠主要受自身遺傳因素或是其它環(huán)境因子的影響。

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)

ANOVA分析表明(表6)：種群間的遺傳變異占總遺傳的21%，種群內(nèi)的占總遺傳變異的79%，說明五角楓的遺傳變異主要來源是種群內(nèi)。

各種群間的遺傳距離從0.0588到0.5027；遺傳一致度從0.6049到0.9429(表7)。種群3和5之間的親緣關(guān)系最近，遺傳一致度最高；種群1和5之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳一致度最低。根據(jù)種群間的遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析(圖2)，5個種群形成明顯的2支：種群1、2和4聚為一支，種群3和5聚為一支。

表3 SRAP引物組合及其擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)

表4 五角楓種群的遺傳多樣性指數(shù)

Na—等位基因總數(shù)；Ne—有效等位基因數(shù)；h—Nei基因多樣性指數(shù)；I—Shannon多樣性指數(shù)；PPB—多態(tài)位點百分率。

表5 各遺傳多樣性指數(shù)與地理因子間的相關(guān)系數(shù)

“*”表示在0.05水平上相關(guān)達(dá)到顯著；“**”表示在0.01水平上相關(guān)達(dá)到顯著。

表6 五角楓種群的遺傳結(jié)構(gòu)(ANOVA分析)

表7 五角楓種群基于Nei 指數(shù)的遺傳距離(對角線下方)和遺傳一致度(對角線上方)

圖2五角楓種群間的遺傳距離聚類圖

Fig 2 Dendrogram ofAcermonomaxim
populations based on genetic distance

3 討論

3.1 五角楓種群的遺傳多樣性

五角楓種群存在著較高的遺傳多樣性，其多態(tài)位點百分率為98.86%，低于用ISSR茶條槭種群的多態(tài)位點百分率(100%)[15]，但高于用RAPD標(biāo)記檢測該屬其他植物(廟臺槭：53.13%；金錢槭：92.97%)[16-17]的多態(tài)位點百分率。

物種的遺傳多樣性不僅是長期進(jìn)化的結(jié)果，也是各種生境因子綜合作用的結(jié)果。植物類群的分類地位、分布范圍、生活史特征、繁育系統(tǒng)、種子擴(kuò)散機(jī)制、分布地區(qū)和演替階段對種群遺傳分化都有明顯影響，而其中的繁育系統(tǒng)、分布范圍和生活史特征對種群遺傳多樣性的影響最大[18]。五角楓為廣泛分布、異交且種子隨風(fēng)傳播或鳥獸取食的木本植物，其種群內(nèi)的遺傳多樣性比種群間的更豐富[19]。

在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，不同植物的遺傳多樣性與海拔之間均有一定的相關(guān)性[20]。本文中，雖然遺傳多樣性指數(shù)與海拔沒有顯著或極顯著相關(guān)，但其遺傳多樣性指數(shù)與海拔呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)，隨著海拔的升高，五角楓的遺傳多樣性隨之加大，但海拔升高到一定程度(2000 m)，其遺傳多樣性開始下降。這是因為，隨著海拔的升高，生存環(huán)境惡劣、基因流動困難，而且海拔升高后，溫度也隨之下降，影響到植物的生活史，從而影響植物的花期、傳粉等可引起遺傳多樣性變化的因素[21]。因而，五角楓的遺傳多樣性在海拔2000 m以下時不斷隨海拔的升高而增加，而到海拔2200 m時又開始下降。同時，野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于低海拔地區(qū)受人為因素影響，植被被砍伐等致使其種群變小，隨之其遺傳多樣性降低。

3.2 五角楓種群的遺傳結(jié)構(gòu)

AMOVA分子變異分析表明，在五角楓種群總的遺傳變異中，有21%來自于種群間，大于瀕危植物翅果油樹的種群間分化(16.79%)[21]，小于同屬植物茶條槭的種間分化(36%)[15]，小于三葉懸鉤子的種間分化(33.03%)[22]。

植物種群的遺傳結(jié)構(gòu)不僅決定于自身遺傳基礎(chǔ)、繁育系統(tǒng)及其起源進(jìn)化進(jìn)程，而且還受到自然選擇、遺傳漂變和基因流等因素的影響[18]。雖然五角楓種群群的遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，但種群群間仍然產(chǎn)生了一定的遺傳分化(21%)(表6，圖2)。五角楓表現(xiàn)這樣的遺傳結(jié)構(gòu)主要原因是：隨著海拔的升高，氣候和植被等也呈現(xiàn)明顯的垂直變化，不同海拔居群所處生境的溫度、光照等生態(tài)因子存在顯著差異，致使不同海拔種群微生境存在差異，最終導(dǎo)致種群間發(fā)生遺傳分化[20]。

另一個影響種群遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素是基因流。 五角楓的基因流(Nm)為0.8094，這個數(shù)值低于一般廣泛分布植物的基因流(Nm=1.881)[23], 揭示出五角楓不同海拔之間有限的基因流。高水平的、穩(wěn)定的基因流可以防止種群間的遺傳分化[22]，不同種群微生境的差異阻礙了花粉和種子的有效傳播，從而導(dǎo)致五角楓種群間的基因交流受限，產(chǎn)生分化。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭萬鈞. 中國樹木志(第4卷)[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2004，4258-4260.

[2]李廣祥. 色木槭、擰勁槭生長分析及生長階段劃分初探 [J]. 吉林林業(yè)科技，2009，38 (5) : 26-28.

[3]顧地周，叢小力，姜云天，等. 色木槭天然次生林種群結(jié)構(gòu)競爭關(guān)系研究 [J]. 植物研究，2012 ，32 (1) : 105-109.

[4]殷東升，葛文志，張鳳海，等. 色木槭次生林種群結(jié)構(gòu)動態(tài)分析 [J]. 林業(yè)科技，2011，36 (6) : 19-22.

[5]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2001，103 : 455-461.

[6]譚江平，曾秀麗，廖明安. 西藏光核桃自然居群遺傳多樣性的SRAP分析 [J].草業(yè)學(xué)報，2012，21 (6) : 213-220.

[7]李楠，柳新紅，李因剛, 等. 白花樹天然群體的遺傳多樣性 [J]. 林業(yè)科學(xué)，2012，48 (11) : 49-56.

[8]馬秀杰，王冠明，韓烈保. 不同產(chǎn)地麥冬遺傳多樣性的SRAP分析 [J].草業(yè)科學(xué)，2012，29 (11) : 1686-1691.

[9]謝文剛，張寶藝，張新全，等. 鴨茅雜交種SRAP分子標(biāo)記鑒定及遺傳分析 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43 (16) : 3288-3295.

[10]姬志峰，高亞卉，李樂，等. 山西霍山五角楓不同海拔種群的表型多樣性分析 [J]. 園藝學(xué)報，2012， 39 (11) : 2217-2228 .

[11]Doyle J J，Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small qualities of fresh leaf material [J]. Phytochem Bull， 1987，19 (1) : 11-15.

[12]Yeh F C，Yang R C，Boyle T. POPGENG，the user friendly shareware for population genetic analysis[M]. Molecular Biology and Biotechnology Center. University of Alberta，Edmonton，Canada. 1997.

[13]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. MEAG4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 [J]. Mol Biol Ivol， 2007，(24) : 1596-1599.

[14]Excoffier L，Smouse P E，Quattro J M. Analysis of molecular variance inferred from metric distance among DNA haplotype applications to human mitochondrial DNA restriction data [J]. Genetics，1992，131: 479-491.

[15]閆女，王丹，王祎玲，等. 七里峪不同海拔茶條槭種群的遺傳多樣性 [J]. 林業(yè)科學(xué)，2010，46 (10) : 50-56.

[16]李珊. 用RAPD標(biāo)記檢測廟臺槭自然居群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化 [D]. 西安: 西北大學(xué), 2001.

[17]李珊. 金錢槭屬植物保護(hù)遺傳學(xué)與分子親緣地理學(xué)研究 [D]. 西安: 西北大學(xué), 2004.

[18]Bradley J，Peterson，Eric Bricker，et al. Genetic diversity and gene flow in Zostera marina populations surrounding Long Island, New York, USA: No evidence of inbreeding, Genetic degradation or population isolation [J]. Aquatic Botany， 2013， 110 (10) : 61-66.

[19]Hamrick J L，Godt M J W ，Sherman-Broyes S L. Factors influencing levels of genetic diversity in woody plant species [J]. New forests，1992， 6 (14) : 95-124.

[20]Ohsawa T，Ide Y. Global patterns of genetic variation in plant species along vertical and horizontal gradients on mountains [J]. Global Ecology and Biogeography， 2008， 17 : 152-163.

[21]秦泳燕，王祎玲，張欽弟，等. 瀕危植物翅果油樹種群的遺傳多樣性和遺傳分化研究 [J]. 武漢植物學(xué)研究，2010，28 (4) : 466-472.

[22]和志嬌，和加衛(wèi)，程在全，等. 三葉懸鉤子自然居群遺傳多樣性的ISSR分析 [J]. 園藝學(xué)報，2012，39 (11) : 2142-2150.

[23]Star B，Spencer H G. Effects of genetic drift and gene flow on the selective maintenance of genetic variation [J]. Genetics， 2013， 194 (1) : 235-244.