太子參超低溫脫毒及規(guī)模化組培育苗技術(shù)

戴 軍， 姚厚軍， 張九玲， 韓邦興， 陳乃富

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院 中藥研究與開發(fā)工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012； 2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012 )

中藥太子參(PseuclostellariaheterophyllaMiq. Pax)來源于石竹科植物太子參的塊根，具補(bǔ)氣健脾、生津潤(rùn)肺、養(yǎng)陰益血等功效，主治脾虛體倦、病后虛弱、氣陰不足、自汗口渴、肺燥干咳等癥[1]。太子參主產(chǎn)安徽、福建、貴州等地。太子參由于長(zhǎng)期留種栽培，積累了大量病毒，嚴(yán)重影響太子參產(chǎn)量和質(zhì)量[2, 3]。太子參病毒病無有效防治藥物，獲得脫病毒太子參植株，進(jìn)行規(guī)?；摱咎訁⒂缡欠乐翁訁⒉《静∽钣行У耐緩絒4, 5]。目前太子參脫病毒及組織培養(yǎng)有較多研究報(bào)道，但多數(shù)是在實(shí)驗(yàn)室條件下研究再生體系[6, 7]，超低溫脫毒在植物上運(yùn)用的研究報(bào)道較多[8-17]，但少見超低溫脫毒和規(guī)?；缂夹g(shù)方面的研究，尤其是太子參超低溫脫毒和規(guī)?；缂夹g(shù)方面還未見報(bào)道。本文選用太子參幼芽，通過超低溫脫毒，采用芽增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，壯苗生根培養(yǎng)，形成太子參超低溫脫毒及規(guī)?；缂夹g(shù)體系，實(shí)現(xiàn)太子參超低溫脫毒及規(guī)?；纭?/p>

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

外植體采自安徽省六安市霍山縣太平畈鄉(xiāng)王家店村，經(jīng)皖西學(xué)院陳乃富教授鑒定為石竹科植物太子參PseuclostellariaheterophyllaMiq. Pax。外植體選用太子參幼芽。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超低溫脫毒

參照香蕉莖尖超低溫脫毒方法[18]并經(jīng)行改良：選取太子參幼芽，將幼芽外層幼葉剝?nèi)ィ〗?jīng)過表面消毒后的1～1.5 mm幼芽接種到附加140 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)接于0℃附加140 g/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基處理40 min，將莖尖置于冷凍管迅速投入液氮，分別保存0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h。從液氮中取出冷凍管，置于40℃水浴解凍1.5 min，備用。

1.2.2 芽增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)

經(jīng)過預(yù)處理的幼芽，轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)移到3000 lx的光照強(qiáng)度下培養(yǎng)。40 d后將成活的莖尖轉(zhuǎn)移到不同的培養(yǎng)基上進(jìn)行再培養(yǎng)。

1.2.3 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

將脫毒后太子參莖尖培養(yǎng)40 d后，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽，培養(yǎng)20 d叢生芽長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)即可轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)；叢生芽亦可以切成段轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)。

1.2.4 生根壯苗培養(yǎng)

芽條長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，切下高于2 cm以上的叢生芽，轉(zhuǎn)接生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根壯苗誘導(dǎo)，其余的轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)。

1.2.5 培養(yǎng)基選擇和培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基：根據(jù)不同需要以改良的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加3.0%蔗糖、0.45%瓊脂和不同種類、不同濃度的激素，pH調(diào)至5.80。

培養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃ ，光照10 h/d，光照強(qiáng)度3000 lx。

1.2.6 脫毒率檢測(cè)

將組織培養(yǎng)獲得的植株用指示植物法檢測(cè)[19]脫毒率。

2 結(jié)果與分析

2.1 超低溫脫毒

由表1可知：對(duì)莖尖超低溫處理有去除病毒的作用，但會(huì)大大降低其成活率；超低溫處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)太子參芽的成活率影響不大，但對(duì)脫毒率有一定影響，處理1 h以上脫毒率較高，脫毒率90%以上。從實(shí)際生產(chǎn)成本考慮，選擇超低溫處理1 h(表1)。

表1 超低溫處理對(duì)成活率及脫毒率影響

注：1、超低溫處理后幼芽在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)上培養(yǎng)20 d，能分化的幼芽判為成活，反之判為死亡；2、培養(yǎng)90 d后用指示植物法檢測(cè)脫毒率。

2.2 芽增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)

將脫毒太子參幼芽經(jīng)過暗培養(yǎng)7 d后的外植體轉(zhuǎn)移到3000 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)40 d后，觀察接種于不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的不定芽數(shù)量和狀態(tài)，結(jié)果如表2。

表2 附加激素種類與濃度的培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

由表2可見：附加激素6-BA、IAA的培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，當(dāng)IAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，隨著6-BA的濃度提高，對(duì)芽的誘導(dǎo)作用也增強(qiáng)，當(dāng)增加到2.5 mg/L對(duì)芽的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，再增加則對(duì)芽的誘導(dǎo)作用有抑制作用。綜合生長(zhǎng)情況，附加2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA的培養(yǎng)基最適宜誘導(dǎo)不定芽。

表3 含不同激素的培養(yǎng)基對(duì)叢生芽的影響

2.3 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

2.3.1 激素種類對(duì)叢生芽的影響

初代培養(yǎng)得到不定芽后需要進(jìn)一步繼代增殖才能得到更多的小苗。在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行增殖培養(yǎng)基的調(diào)整。將初代培養(yǎng)得到的不定芽切割成單苗接種于繼代增殖培養(yǎng)基中。

由表3結(jié)果可看出：附加激素1.0 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA和1.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA這兩種培養(yǎng)基出芽多，生長(zhǎng)快，顏色綠，苗生長(zhǎng)粗壯，葉片寬大，結(jié)合生長(zhǎng)狀態(tài)附加1.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)效果最佳。激素KT對(duì)芽的誘導(dǎo)影響強(qiáng)于6-BA。

2.3.2 KT濃度對(duì)叢生芽的影響

在篩選出最適激素基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了KT濃度對(duì)叢生芽的影響，結(jié)果見表4。隨著細(xì)胞分裂素KT濃度的升高，叢生芽的增殖倍數(shù)不斷增加，苗生長(zhǎng)的越來越快，長(zhǎng)勢(shì)越來越好。當(dāng)KT濃度達(dá)到1.2 mg/L時(shí)，叢生芽增殖倍數(shù)最高，出芽快，生長(zhǎng)快，苗顏色綠而且粗壯，長(zhǎng)勢(shì)最好。而后隨著KT濃度的升高，增殖倍數(shù)不斷下降，越來越抑制苗的生長(zhǎng)。因此，KT濃度為1.2 mg/L左右時(shí)是對(duì)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的最宜濃度。

表4 不同濃度KT對(duì)叢生芽的影響

2.4 壯苗生根培養(yǎng)

將增殖后的太子參苗分別轉(zhuǎn)接于壯苗生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其茁壯生長(zhǎng)及生根，為煉苗做好準(zhǔn)備。

2.4.1 不同激素種類及濃度對(duì)壯苗生根培養(yǎng)的影響

表5 不同激素種類對(duì)壯苗生根培養(yǎng)的影響

表5結(jié)果表明：激素NAA和DA-6均能誘導(dǎo)根的產(chǎn)生，DA-6更適宜壯苗生根培養(yǎng)。DA-6培養(yǎng)出來的苗粗壯，顏色綠，產(chǎn)生的根系也多并且粗壯，部分產(chǎn)生塊根，而NAA培養(yǎng)出來的苗纖細(xì)，顏色泛黃，雖然可以誘導(dǎo)根的產(chǎn)生，但是根比較纖細(xì)。

2.4.2 不同濃度的DA-6對(duì)壯苗生根培養(yǎng)的影響

表6 不同濃度的DA-6對(duì)壯苗生根培養(yǎng)的影響

由表6可以看出：隨著DA-6的濃度增加，對(duì)根系誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，當(dāng)濃度為1.5 mg/L時(shí)作用最強(qiáng)，濃度超過1.5 mg/L時(shí)對(duì)根的誘導(dǎo)有抑制作用。當(dāng)DA-6濃度為1.5 mg/L，KT濃度為0.2 mg/L時(shí)是最適宜壯苗生根的培養(yǎng)基，根系發(fā)達(dá)而且產(chǎn)生塊根，更佳利于太子參的生長(zhǎng)。

2.4.3 不同有機(jī)添加物對(duì)壯苗生根培養(yǎng)的影響

表7 不同有機(jī)添加物對(duì)壯苗培養(yǎng)的影響

由表7可以看出添加有機(jī)物對(duì)太子參莖葉和根系生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，促進(jìn)塊根的形成和生長(zhǎng)，有機(jī)添加物以蛋白粉最好。

3 討論

通過超低溫對(duì)太子參莖尖進(jìn)行處理，采用以芽誘導(dǎo)叢生芽方式進(jìn)行增殖，與莖尖分生組織法和熱處理結(jié)合莖尖分生組織法相比，本方法操作簡(jiǎn)便、成本低，適宜于太子參規(guī)?；摱?。通過脫毒太子參組培快繁技術(shù)研究，優(yōu)化出適合脫毒太子參誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基為改良MS+2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA；繼代增殖最適宜培養(yǎng)基為改良MS+1.2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA；最高增殖倍數(shù)可達(dá)12.5倍；壯苗生根最適宜培養(yǎng)基為改良MS+0.2 mg/L KT+ 1.5 mg/L DA-6+10%蛋白粉，壯苗生根培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生了大量根系及塊根。該技術(shù)成果成功轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)了脫毒太子參規(guī)?；纭?/p>

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