硒對(duì)氧化應(yīng)激小白鼠肝臟酶活的影響

李麗娟

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息學(xué)院，山西 太谷 030801)

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)產(chǎn)生過(guò)多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致組織損傷。線粒體呼吸鏈復(fù)合體利用電子傳遞生產(chǎn)ATP,是ROS的主要來(lái)源[1],肝臟含有豐富的線粒體,因此也是ROS攻擊的主要器官。D-半乳糖分子式C6H12O7，分子量196.16?？蓮囊掖贾兄亟Y(jié)晶。屬于糖酸類型，性質(zhì)與葡萄糖酸類似，能被過(guò)量氧化劑(如HIO4)氧化，分解成甲醛、乙醛酸。半乳糖是動(dòng)物體內(nèi)的正常代謝產(chǎn)物。哺乳動(dòng)物從乳糖中獲得半乳糖，乳糖在體內(nèi)水解生成葡萄糖和半乳糖，而半乳糖則在肝臟中迅速被酶解成葡萄糖。半乳糖代謝異常會(huì)引起動(dòng)物生理功能顯著變化。過(guò)量D-半乳糖的給予導(dǎo)致了機(jī)體代謝率的提高，由此產(chǎn)生了由于自由基的增加而引起的一系列與氧化應(yīng)激相關(guān)的病理生理學(xué)變化。本研究以D-半乳糖為氧化劑,研究氧化應(yīng)激對(duì)肝臟幾種酶活的影響,為動(dòng)物肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制及診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

隨機(jī)選取45日齡36只昆明品系雄性小鼠,按體重相近原則將36只小白鼠分為3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3只小白鼠。每組小白鼠在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)分別進(jìn)行處理：1組為對(duì)照組，硒水平0.3 mg·kg-1W,腹腔注射10 mg·kg-1W的生理鹽水；2組為低硒應(yīng)激組，硒的水平0.3 mg·kg-1W，腹腔注射D-半乳糖150 mg·kg-1W，連續(xù)4周；3組高硒應(yīng)激組，硒的水平0.6 mg·kg-1W，腹腔注射D-半乳糖150 mg·kg-1W，連續(xù)4周。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，摘除眼球采血，然后屠宰所有試驗(yàn)小白鼠，迅速剖開(kāi)腹腔，分離出肝臟，放入冰凍的生理鹽水中沖洗干凈，濾紙吸干，迅速液氮冷凍，-80℃保存用于檢測(cè)酶活。

1.2 肝臟氧化還原狀態(tài)檢測(cè)

GSH-PX活性測(cè)定：DTNB法；總抗氧化能力(T-AOV)測(cè)定、丙二醛(MDA)：硫代巴比妥酸法。具體方法參照南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 血清肝功能指標(biāo)酶活測(cè)定

1.3.1 乳酸脫氫酶測(cè)定[2]

按表1順序操作。

混勻后,室溫靜置5 min后440 nm比色，以蒸餾水調(diào)零點(diǎn),讀取兩管A，求出LDH活力。

1.3.2 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)[3]

按表2順序加入反應(yīng)物。

表1乳酸脫氫酶活性的測(cè)定

Table1 The determination of lactate dehydrogenase activity/mL

試劑Reagent測(cè)定管The detective tube對(duì)照管The CK tube血清(1∶5稀釋)乳酸鈉緩沖液37℃水浴3 minNAD+蒸餾水37℃水浴15 min2、4-二硝基苯肼37℃水浴15 min0.4 mol·L-1 NaOH0.050.50.1-0.550.050.5-0.10.55

表2谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定

Table2 The determination of Alanine transaminase activity/mL

試劑Reagent測(cè)定管Thedetectivetube空白管Theblanktube對(duì)照管The CKtubeALT基質(zhì)液37℃恒溫水浴溫?zé)?～3 min樣本蒸餾水37℃恒溫水浴溫?zé)?0 min2,4-二硝基苯肼液混勻后在室溫下置20 min0.4 mol·L-1氫氧化鈉溶液1.00.2-1.010.01.00.2-1.010.01.0-0.21.010.0

混勻后在室溫下靜置5 min，用蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查取各自的ALT含量。

1.3.3 堿性磷酸酶(ALP)[3]

按表3順序加入反應(yīng)物。

立即混勻。用510 nm波長(zhǎng)比色，以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度。計(jì)算出ALP含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 17.0.0 one-way ANOVA For Windows數(shù)據(jù)分析軟件處理。所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Duncan法進(jìn)行多重比較。

表3堿性磷酸酶測(cè)定

Table3 The determination of Alkaline phosphatase activity/mL

試劑Reagent測(cè)定管Thedetectivetube標(biāo)準(zhǔn)管Thestandardtube空白管Theblanktube對(duì)照管TheCKtube樣本酚標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水pH10碳酸鹽緩沖液混勻37℃水浴保溫5 min同時(shí)將底物預(yù)熱底物液混勻37℃水浴保護(hù)15 min鐵氰化鉀溶液樣本0.100--1.001.003.00--0.100-1.001.003.00---0.1001.001.003.00----1.001.003.000.100

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟氧化還原狀態(tài)

肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的指標(biāo)變化如表4。從表4可以看出,與對(duì)照組相比,低硒應(yīng)激組GSH-PX活性、T-AOC含量極顯著降低，MDA濃度極顯著升高；高硒應(yīng)激組GSH-PX活性、T-AOC水平和MDA濃度與對(duì)照組差異不顯著。從表4的結(jié)果分析，腹腔注射D-半乳糖150 mg·kg-1W,可以使小白鼠處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，0.3 mg·kg-1W硒水平抗應(yīng)激效果效果顯著，0.6 mg·kg-1W硒水平的抗應(yīng)激效果顯著。

表4 不同處理肝臟氧化還原指標(biāo)的影響

注: 同列不同行數(shù)據(jù)不同肩注小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。表5同。

Note: The data different shoulder within the same column note lowercase letters mean significant difference (P<0.05), and different capital letters showed extremely significant difference (P<0.01).The same as table 5.

2.2 氧化應(yīng)激對(duì)肝臟酶活的影響

由表5可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，低硒組LDH活性極顯著降低，高硒組LDH活性差異不顯著，低硒組與高硒組差異顯著。與對(duì)照組相比，低硒應(yīng)激組ALT活性極顯著下降，ALP活性極顯著升高;高硒應(yīng)激組ALT和ALP活性與對(duì)照組差異不顯著。綜合LDH、ALT和ALP活性分析結(jié)果，氧化應(yīng)激引起了小白鼠肝臟的損傷，0.3 mg·kg-1W硒水平改善肝臟的氧化損傷效果不明顯。0.6 mg·kg-1W硒水平具有良好的改善肝臟損傷的效果。

表5氧化應(yīng)激對(duì)肝臟酶活的影響

Table5 The effect of oxidative stress on the activity of the enzymes in liver

組別GroupsLDH/U·L-1ALT/U·mL-1ALP/U·L-1對(duì)照組低硒應(yīng)激組高硒應(yīng)激組370.82±1.02aA298.1 ±0.36bB 359.2±0.87a 0.06±0.03aA0.028±0.96bB0.056±0.11ac28±0.03aA50±0.03bB30±0.03ac

3 結(jié)論與討論

3.1 氧化還原狀態(tài)的評(píng)價(jià)

T-AOC是反映機(jī)體抗氧化水平高低的重要指標(biāo)，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程產(chǎn)生的羰基類物質(zhì)，其含量高低反映了機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，MDA具有細(xì)胞毒性，能引發(fā)機(jī)體的多種疾病。吳伶艷研究表明氧化酪蛋白是小鼠組織和血液中的T-AOC和GSH-PX活性顯著下降，MDA含量顯著升高[4]。施用暉等研究報(bào)道高脂飲食使小鼠腸道的MDA含量顯著升高，T-AOC活性顯著下降[5]。

硒在生物體內(nèi)的抗氧化作用分為酶和非酶2類。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最重要的一種含硒酶，GSH-PX能分解體內(nèi)不飽和脂質(zhì)氧化所產(chǎn)生的過(guò)氧化物，從而防止對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞功能的過(guò)度氧化造成損害[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，低硒應(yīng)激組GSH-PX活性、T-AOC活性極顯著下降，MDA濃度極顯著升高，高硒應(yīng)激組差異不顯著，與付青姐、張斌等報(bào)道的結(jié)果一致[7,8]。

3.2 硒對(duì)氧化應(yīng)激小鼠肝臟酶活的影響

乳酸脫氫酶是無(wú)氧酵解和糖異生的重要酶系之一，在體內(nèi)能量代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，幾乎存在于所有組織中，任何原因引起的肝細(xì)胞損傷均可因乳酸脫氫酶逸出，引起乳酸脫氫酶濃度增加[9]。研究表明，乳酸脫氫酶濃度可以反映肝臟損傷情況，乳酸脫氫酶增加，細(xì)胞周期減慢，細(xì)胞增殖活性降低[10]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，低硒應(yīng)激組乳酸脫氫酶活性極顯著的增高，高硒應(yīng)激組差異不顯著，說(shuō)明0.6 mg·kg-1W的硒水平具有較好的抗氧化功能。

ALT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，其細(xì)胞內(nèi)濃度高于血清中1000～3000倍。只要有1%的肝細(xì)胞壞死，就可以使血清酶增高一倍。因此，ALT被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)。本研究結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，低硒應(yīng)激組乳酸脫氫酶活性極顯著的增高，高硒應(yīng)激組差異不顯著，說(shuō)明0.6 mg·kg-1W的硒水平具有較好的抗氧化功能，與楊曉軍等研究結(jié)果一致[11]。

堿性磷酸酶是一種廣泛分布的含鋅膜結(jié)合糖蛋白，為基質(zhì)小泡和質(zhì)膜的標(biāo)記酶[12]。當(dāng)肝臟受到損傷或者障礙時(shí)經(jīng)淋巴道和肝竇進(jìn)入血液，而引起血清堿性磷酸酶明顯升高。本文的研究結(jié)果與康紹樂(lè)等研究結(jié)果一致[13]。

參 考 文 獻(xiàn)

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