日糧能量水平對1.5～3.5月齡獺兔免疫性能及肝臟IFN-γ表達(dá)的影響

常萬波，任戰(zhàn)軍，韓 營，宋洪新，頡宏兵

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 甘肅康園生態(tài)農(nóng)牧有限公司，甘肅 甘谷 741200)

獺兔是皮肉兼用兔，經(jīng)濟(jì)價值很高。但獺兔抗病力較弱，尤其是幼齡獺兔，而且患病后難以治愈，死亡率很高，使獺兔的飼養(yǎng)規(guī)模受到限制[1]。能量是機(jī)體維持生命活動及物質(zhì)代謝的最基本營養(yǎng)物質(zhì)。關(guān)于獺兔的能量需要量，國外的研究一般認(rèn)為在10.04～11.72 MJ/kg[2]，美國NRC的推薦量為10.46 MJ/kg[3]。任克良等[4]研究認(rèn)為，獺兔的適宜能量水平為10.47～10.71 MJ/kg。日糧能量水平的高低，會影響獺兔的生長、繁殖、免疫能力等[5]。結(jié)合獺兔能量水平調(diào)控對免疫的影響，尋求對免疫有積極作用的合理的能量水平，將會減少藥物使用量，避免藥物在兔體內(nèi)殘留，促進(jìn)獺兔健康生長，對獺兔業(yè)的發(fā)展有很大的實際意義。

本試驗以1.5～3.5月齡獺兔為研究對象，在其他各種營養(yǎng)素均滿足需要的情況下，探討飼喂不同能量水平日糧對獺兔免疫器官指數(shù)、免疫球蛋白以及IFN-γ表達(dá)的影響，從而為獺兔最佳能量供給水平的確定及獺兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

160只質(zhì)量為(1.133±0.071) kg的1.5月齡獺兔，由甘肅康園生態(tài)農(nóng)牧有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

采用單因子隨機(jī)試驗設(shè)計，將160只試驗獺兔隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4組，每組40只。日糧組成參照美國NRC頒布的兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[3]，配制成消化能分別為9.7，10.5，11.3和12.1 MJ/kg的4種日糧，將其加工制成顆粒料，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組獺兔分別飼喂上述4種日糧，各組飼糧的組分及其營養(yǎng)水平見表1。本試驗預(yù)試期為7 d，然后進(jìn)入正試期，試驗時間為2個月，每月采樣1次，采樣時每組取6只進(jìn)行屠宰，并取樣用于分析。

表1 各試驗組獺兔日糧組成及其營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗兔在同舍內(nèi)單籠飼喂，常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 免疫器官指數(shù) 試驗兔屠宰后取肝臟和脾臟稱質(zhì)量，按下式計算免疫器官指數(shù)：

肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/活體質(zhì)量；

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/活體質(zhì)量。

1.4.2 免疫球蛋白 (1)血清IgG含量。屠宰前進(jìn)行心臟采血，每只采血樣10 mL左右，以3 000 r/min 低溫(4 ℃)離心15 min，制備血清樣品，-20 ℃保存，用于測定血液IgG含量。(2)小腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量。屠宰后取一段十二指腸，用生理鹽水沖洗干凈，剪開腸段，用載玻片刮取小腸黏膜裝入無酶管，-80 ℃保存。小腸黏膜SIgA含量采用ELISA試劑盒測定，該試劑盒購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司。

1.4.3IFN-γ表達(dá)量 屠宰時取肝臟樣品裝入無酶管，液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(1)總RNA的提取。Trizol一步抽離法提取獺兔總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用核酸蛋白儀測定總RNA濃度和純度。

(2)引物的設(shè)計與合成。以GAPDH(GenBank登錄號為AF017079)為參照基因，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計定量PCR引物。GAPDH上游引物：5′-ACT CTG GCA AAG TGG ATG TTG TCG-3′；下游引物：5′-TTG ATG ACC AGC TTC CCG TTC TCA-3′。IFN-γ上游引物：5′-CTG CCT CAT CTT GGG TTC TTA C-3′；下游引物：5′-TGT TGT CAC TCT CCT CTT TCC A-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(3)Real-time PCR。反轉(zhuǎn)錄與Real-time PCR均采用大連寶生物工程有限公司的試劑盒，具體操作見說明書。Real-time PCR時每個樣品設(shè)3個重復(fù)，采用2-ΔΔCt計算樣品中IFN-γ的相對表達(dá)量[6]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧能量水平對獺兔免疫器官指數(shù)的影響

由表2可以看出，2.5月齡時，獺兔肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)從Ⅰ組到Ⅳ組均呈增長趨勢，Ⅰ組獺兔的肝臟指數(shù)與Ⅲ、Ⅳ組獺兔達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)，Ⅰ組獺兔的脾臟指數(shù)與Ⅳ組獺兔差異顯著(P<0.05)。3.5月齡時，獺兔肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)從Ⅰ組到Ⅳ組呈先增大后減小的趨勢，各組間肝臟指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，但Ⅰ組與Ⅲ組之間脾臟指數(shù)差異顯著(P<0.05)。

表2 日糧能量水平對獺兔免疫器官指數(shù)的影響

2.2 日糧能量水平對獺兔免疫球蛋白的影響

由表3可以看出，2.5月齡時，Ⅱ組獺兔的血液IgG含量最高，Ⅳ組其次，Ⅰ組最低。其中Ⅱ、Ⅳ組血液IgG含量與Ⅰ和Ⅲ組均達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)。小腸黏膜SIgA含量各組間差異不顯著(P>0.05)。

3.5月齡時，Ⅰ到Ⅳ組獺兔血液IgG含量呈先上升后下降的趨勢，其中Ⅰ組與Ⅲ組血液IgG含量差異顯著(P<0.05)。小腸黏膜SIgA含量從Ⅰ到Ⅳ組也基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，以Ⅲ組含量最高，其中Ⅲ組與Ⅰ、Ⅱ組小腸黏膜SIgA含量的差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.3 日糧能量水平對獺兔肝臟IFN-γ表達(dá)量的影響

由表4可以看出，隨著日糧能量水平的提高，獺兔肝臟IFN-γ表達(dá)量隨之增加。2.5月齡時，Ⅰ組與Ⅳ組獺兔肝臟IFN-γ表達(dá)量差異顯著(P<0.05)；3.5月齡時，Ⅳ組與Ⅰ、Ⅱ組獺兔肝臟IFN-γ表達(dá)量的差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表3 日糧能量水平對獺兔免疫球蛋白的影響

表4 日糧能量水平對獺兔肝臟IFN-γ表達(dá)的影響

3 討 論

免疫器官指數(shù)是衡量動物免疫功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，也是評價營養(yǎng)對機(jī)體免疫功能影響的常用參數(shù)[7]。一般認(rèn)為，在動物健康的情況下，免疫指數(shù)越大表明動物的免疫力越強(qiáng)[8]。祝素珍等[2]研究表明，日糧能量水平與新西蘭兔免疫器官指數(shù)間的關(guān)系無一定規(guī)律性；多樂等[9]研究表明，高能量和高蛋白水平日糧可以促進(jìn)胸腺的發(fā)育，進(jìn)而提高動物的免疫水平；王遠(yuǎn)孝等[10]報道，黃羽肉雞的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)隨日糧能量水平先升高后降低，但各處理組間差異不顯著。本試驗發(fā)現(xiàn)，2.5月齡時，隨日糧能量水平的增加，獺兔的脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)亦隨之增加；但到3.5月齡時，獺兔的脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)隨日糧能量水平的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，表明獺兔在生長階段的早期需要較多能量。這與國內(nèi)學(xué)者推薦的3～12周齡生長兔的消化能水平為 12.12 MJ/kg，12 周齡以后的消化能需要量為 10.45～11.29 MJ/kg相符[11]。在日糧其他營養(yǎng)素相同的情況下，隨日糧能量水平的升高，2.5月齡獺兔免疫器官指數(shù)也有升高，表明能量水平越高，獺兔免疫器官發(fā)育越完善，其免疫功能越好；至3.5月齡時，第Ⅳ組獺兔免疫指數(shù)下降，可能是因為當(dāng)時夏季炎熱的天氣影響了最高能組獺兔的采食量所致。

IgG是血清免疫球蛋白的主要成分，約占血清免疫球蛋白總量的75%，在體液免疫中發(fā)揮著重要作用[12]。消化道黏膜固有膜內(nèi)的淋巴組織可產(chǎn)生大量的SIgA，在黏膜表面形成免疫保護(hù)層，對抵抗病原微生物的入侵起著重要作用。SIgA不僅能防止病原微生物在黏膜表面的吸附，還可捕獲進(jìn)入黏膜內(nèi)層的病原體，所以在防止消化道感染方面具有重要作用[13]。免疫球蛋白質(zhì)量濃度或效價的高低反映機(jī)體免疫水平的高低，其質(zhì)量濃度或效價越高，表明機(jī)體的免疫水平越高[14]。本試驗發(fā)現(xiàn)，3.5月齡時，第Ⅲ組獺兔血清IgG及小腸黏膜SIgA含量最高，并顯著高于第Ⅰ組。這表明隨日糧能量水平升高，血清IgG和小腸黏膜SIgA分泌量增加；第Ⅳ組獺兔免疫球蛋白含量相對于第Ⅲ組有所下降，表明過高的能量不但不利于獺兔免疫球蛋白的分泌，而且影響獺兔的身體健康。2.5月齡時，試驗兔血清IgG含量出現(xiàn)較大波動，而各組間小腸黏膜SIgA分泌量差異不顯著，可能是試驗期間的氣溫變化使獺兔出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)所致。

IFN-γ也稱免疫干擾素，屬于Th1型細(xì)胞因子，主要具有促進(jìn)細(xì)胞免疫的作用，其是由原初的THO和TH1的CD4+輔助性T細(xì)胞和幾乎所有的CD8+細(xì)胞產(chǎn)生，可以特異性地誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)，直接促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖分化、CTL成熟和B淋巴細(xì)胞分泌抗體[15]。研究表明，IFN-γ具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲等作用[16]。本試驗結(jié)果顯示，在2.5和3.5月齡2個階段，獺兔肝臟IFN-γ表達(dá)量均隨日糧能量水平的升高而逐漸上升，并且最高能量組的IFN-γ表達(dá)量顯著高于最低能量組，這說明能量可以促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)，進(jìn)而促使IFN-γ分泌，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫性能。獺兔肝臟IFN-γ表達(dá)量在日糧能量最高組達(dá)到最大值，可能是由于肝臟作為機(jī)體新陳代謝最旺盛的器官，較其他器官或組織需要更多的營養(yǎng)供應(yīng)。

4 結(jié) 論

在日糧能量水平為9.7～11.3 MJ/kg時，日糧能量水平的升高能夠提高獺兔的免疫器官指數(shù)，促進(jìn)獺兔免疫球蛋白的分泌以及肝臟IFN-γ的表達(dá)，生長獺兔較適宜的消化能水平為11.3 MJ/kg。

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