赤芍活性成分微波輔助提取工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究

劉春葉，王　拓，程傳栩，聶太雷

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,陜西 西安710021)

赤芍是毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)或川赤芍(PaeoniaveitchiiLynch)的干燥根，呈圓柱形，稍彎曲，氣微香，味微苦、酸澀[1]，具有清熱涼血、散瘀止痛的功效。

微波萃取是利用微波快速加熱的特性，并結(jié)合傳統(tǒng)溶劑提取法而發(fā)展的一種針對(duì)固體樣品的新萃取技術(shù)。與傳統(tǒng)中草藥提取方法相比，微波萃取具有浸提時(shí)間短、效率高、加熱均勻、安全環(huán)保等特點(diǎn)[2-5]。

響應(yīng)曲面法(RSM)是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合的產(chǎn)物，可用來(lái)對(duì)響應(yīng)值受多個(gè)變量影響的問(wèn)題進(jìn)行建模和分析，其最終目的是優(yōu)化該響應(yīng)值[6]。采用響應(yīng)曲面法可以建立連續(xù)變量曲面模型，對(duì)影響生物過(guò)程的因子及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定最佳水平范圍。

目前，關(guān)于微波輔助提取赤芍活性成分的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。作者擬建立赤芍活性成分的微波輔助提取法，并采用單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)曲面法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，為更好地對(duì)赤芍活性成分進(jìn)行提取、評(píng)價(jià)其藥用價(jià)值提供幫助。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　材料與儀器

赤芍藥材(產(chǎn)地安徽、甘肅、陜西)，購(gòu)自西安市萬(wàn)壽路中藥材市場(chǎng)，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室張寒老師鑒定符合藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。將赤芍在40 ℃下烘干，粉碎，過(guò)40目篩，得赤芍粉。

FW-200型萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Beckman P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀，中國(guó)貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司北京分公司；標(biāo)準(zhǔn)40目檢驗(yàn)篩，上虞大亨橋化驗(yàn)儀器廠；CMD-20X型恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XH-300A型電腦微波超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；RE-200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Anke TDL-40B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-2102PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司。

1.2　提取方法

為了保證實(shí)驗(yàn)效果和藥材的合理利用，經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算，每次實(shí)驗(yàn)所用赤芍粉為1.0 g。

稱取1.0 g赤芍粉置于250 mL圓底三頸燒瓶中，加入溶劑，在一定的微波功率、提取溫度、提取時(shí)間、液料比下進(jìn)行微波輔助提取，補(bǔ)重，濃縮提取液，定容，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，以最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行提取效果對(duì)比。

1.3　毛細(xì)管電泳條件

采用75μm內(nèi)徑熔融石英毛細(xì)管柱(總長(zhǎng)65 cm，有效長(zhǎng)度60 cm)；分離電壓20 kV；壓力進(jìn)樣：0.5 psi×5 s，正極端進(jìn)樣，陰極端檢測(cè)；分離溫度25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；由Beckman P/ACE工作軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果與討論

2.1　單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取溫度對(duì)提取效果的影響

固定液料比40∶1(mL∶g，下同)、提取時(shí)間20 min、微波功率1 000 W，考察提取溫度(20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　提取溫度對(duì)提取效果的影響

由圖1可以看出，隨著提取溫度的升高，提取量先升高后降低，在80 ℃達(dá)到最高。這可能是因?yàn)?，在一定的范圍?nèi)，隨著提取溫度的升高，提取物在溶劑中的溶解度增大，提取量相應(yīng)升高；但當(dāng)提取溫度過(guò)高時(shí)，溶劑部分揮發(fā)導(dǎo)致提取量降低；另一方面，當(dāng)提取溫度過(guò)高時(shí)，赤芍活性成分發(fā)生部分水解，由水溶性變成脂溶性，導(dǎo)致其在水中的溶解度變小，吸光度減小，提取量降低。

2.1.2液料比對(duì)提取效果的影響

固定提取溫度80 ℃、提取時(shí)間20 min、微波功率1 000 W，考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1)對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，在液料比為70∶1時(shí)，提取量達(dá)到最高。這可能是因?yàn)椋?dāng)液料比較小時(shí)，溶出的活性成分較少；當(dāng)液料比增大到一定值后，可以將赤芍活性成分充分溶出，此時(shí)提取液中的活性成分含量最多；當(dāng)液料比繼續(xù)增大，活性成分不再溶出，提取量不再升高。

圖2　液料比對(duì)提取效果的影響

2.1.3提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

固定提取溫度80 ℃、液料比70∶1、微波功率1 000 W，考察提取時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min)對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

由圖3可以看出，在提取時(shí)間為70 min時(shí)，提取量達(dá)到最高。這可能是因?yàn)?，提取時(shí)間越長(zhǎng)，赤芍活性成分在水中溶解量越多；提取一定時(shí)間后，赤芍活性成分向溶劑中的擴(kuò)散速率與藥物殘?jiān)鼘?duì)活性成分的吸附速率相等，提取液達(dá)到最大濃度，此時(shí)吸光度達(dá)到最大值，提取量達(dá)到最高。

2.2　響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1Box-Behnken設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)曲面法進(jìn)行微波輔助提取赤芍活性成分的條件優(yōu)化。Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1，響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸分析見(jiàn)表3。

表1　Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素水平表

表2　響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2得到相應(yīng)的二次模型方程：Y=0.26+0.022A-0.001266B+0.008747C+0.014AB+0.007683AC+0.0001690BC+0.007036A2-0.013B2-0.009223C2。

由表3可知，二次模型的P值為0.03575，表明該模型顯著；因素A的P值為0.0343，表明提取溫度對(duì)提取效果影響顯著。

根據(jù)響應(yīng)曲面得出的等高線和曲面圖分析各個(gè)因素之間的相互交叉影響。等高線的投影越接近橢圓，三維曲面圖越陡峭、最高點(diǎn)越突出，說(shuō)明該因素對(duì)應(yīng)變量的影響越顯著，其P值越小，方程中的絕對(duì)值越大。P值小于0.05的可以認(rèn)為是有交互作用，曲面顏色的深淺則表示該區(qū)域?qū)嶒?yàn)組合的優(yōu)劣[7]。

提取溫度、提取時(shí)間、液料比之間的交互作用見(jiàn)圖4。

表3　回歸分析結(jié)果

由圖4a可看出，當(dāng)液料比(C)為70∶1時(shí)，等高線橢圓效果不好，提取溫度和提取時(shí)間的交互作用不明顯，與表3結(jié)果一致(AB兩者的P值為0.2865>0.05，無(wú)交互作用)。

由圖4b可看出，當(dāng)提取時(shí)間(B)為70 min時(shí)，等高線橢圓效果不好，兩者交互作用不明顯，與表3結(jié)果一致(AC兩者的P值為0.5385>0.05，無(wú)交互作用)。

由圖4c可看出，當(dāng)提取溫度(A)為80 ℃時(shí)，等高線接近于圓，交互作用不明顯，與表3結(jié)果一致(BC兩者的P值為0.9890>0.05，無(wú)交互作用)。

采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，確定赤芍活性成分的最優(yōu)提取條件為：提取溫度89.99 ℃、提取時(shí)間75.32 min、液料比79.25∶1(mL∶g)，此時(shí)，赤芍水提液的吸光度預(yù)測(cè)值為0.3022，實(shí)測(cè)值為0.2899。表明該模型預(yù)測(cè)效果良好。

2.3　毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)

在最優(yōu)條件下微波輔助提取赤芍活性成分，采用毛細(xì)管電泳法進(jìn)行分離檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，赤芍水提液中所含組分相對(duì)較少。

2.4　不同產(chǎn)地赤芍活性成分的差異分析

在最優(yōu)提取條件下，分別對(duì)安徽、甘肅、陜西3個(gè)產(chǎn)地的赤芍活性成分進(jìn)行含量分析。將各水提液在200～400 nm進(jìn)行紫外掃描，根據(jù)最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度大小判斷不同產(chǎn)地赤芍活性成分的含量差異，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖4　提取溫度、提取時(shí)間、液料比之間的交互作用

圖5　赤芍水提液的毛細(xì)管電泳圖譜

由圖6可看出，陜西產(chǎn)赤芍水提液活性成分的含量稍大于甘肅和安徽，安徽和甘肅產(chǎn)赤芍水提液的活性成分含量接近。表明不同產(chǎn)地赤芍的活性成分含量存在一定的差異。

3　結(jié)論

以水為溶劑，采用微波輔助提取法對(duì)赤芍活性成分進(jìn)行提取。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、Box-Behnken 設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法，借助Design Expert 8.0.6 軟件，對(duì)赤芍活性成分的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定最優(yōu)提取條件為：提取溫度89.99 ℃、提取時(shí)間75.32 min、液料比79.25∶1(mL∶g)，此時(shí)，赤芍水提液的吸光度預(yù)測(cè)值為0.3022，實(shí)測(cè)值為0.2899。該方法預(yù)測(cè)效果良好，可為中藥活性成分的微波輔助提取提供參考。

圖6　不同產(chǎn)地赤芍水提液的紫外吸收光譜

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