MCI前處理-UPLC法測定西洋參莖葉中7種人參皂苷含量

逄世峰，孫成賀，李亞麗，趙景輝，王英平

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130112)

西洋參莖、葉為五加科人參屬植物西洋參(PanaxquinquefoliumL.)的地上部分，亦具有多種藥理活性[1，2]，人參皂苷為其中主要化學(xué)成分[3]。目前西洋參莖、葉中人參單體皂苷的測定主要采用高效液相色譜法[4，5]，此法分析時間較長，而且莖、葉中葉綠素對色譜柱污染嚴重。MCI凝膠柱是小孔樹脂凝膠柱(聚苯乙烯基的反相樹脂填料)，是在三菱化學(xué)Diaion和Sepabeads大孔吸附樹脂基礎(chǔ)上設(shè)計的，去除色素效果較好。超高效液相色譜(UPLC)為目前被證實最高效的分離儀器，在中藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6]。本試驗建立一種MCI前處理-UPLC法測定西洋參莖、葉中7種人參皂苷含量的快速檢測方法，旨在為西洋參莖、葉中人參皂苷含量測定和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器、試劑和材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC，waters公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；電子分析天平(sartorius CPA225D型)；

1.2 試劑

乙腈為色譜純(fisher公司)，水為超純水。

1.3 材料

人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd(購自中國藥品生物制品檢定所)；西洋參采自吉林省和龍市，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所許世泉副研究員鑒定為五加科植物西洋參莖、葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液制備

精密稱取7種人參皂苷標準品適量，配置成人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd含量分別為0.334mg/mL、0.756mg/mL、0.649mg/mL、0.217mg/mL、0.221mg/mL、0.424mg/mL、0.43mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，流動相乙腈-水(梯度洗脫：0min～3min，17%～19%乙腈；3min～4min，19%～21%乙腈；4min～5min，21%～26%乙腈；5min～9min，26%～27%乙腈；9min～12min，27%～32%乙腈；12min～15min，32%～43%乙腈)[3]，流速0.5mL/min，檢測波長為203nm，柱溫35℃，進樣量2μL。

A.樣品；B.標準品；1.人參皂苷Rg1；2.人參皂苷Re；3.人參皂苷Rb1；4.人參皂苷Rc；5.人參皂苷Rb2；6.人參皂苷Rb3；7.人參皂苷Rd。

2.3 線性關(guān)系

將混合對照品溶液分別用甲醇稀釋1倍、1.5倍、2倍、4倍、50倍，制成一系列濃度的混合標準品溶液，在上述色譜條件下，注入超高效液相色譜儀。以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程分別為：Rg1：Y=497 000X-2 380(r=0.999 5)，Re：Y=651 000X-5 240(r=0.999 5)，Rb1：Y=482 000X-4 150(r=0.999 5)，Rc：Y=546 000X-2 540(r=0.999 3)，Rb2：Y=573 000X-2 170(r=0.999 4)，Rb3：Y=505 000X-3 630(r=0.999 3)，Rd：Y=433 000X-2 780(r=0.999 5)。人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd線性范圍分別為0.006 7mg/mL～0.334mg/mL，0.015 1mg/mL～0.756mg/mL，0.013 0mg/mL～0.649mg/mL，0.004 3mg/mL～0.217mg/mL，0.004 4mg/mL～0.221mg/mL，0.008 5mg/mL～0.424mg/mL，0.008 6mg/mL～0.43 mg/mL。

2.4 供試品溶液的制備

取西洋參莖、葉洗凈，經(jīng)50℃烘干，粉碎(過60目篩)，取西洋參莖、葉粉末0.1g，精密稱定，置10mL容量瓶中，加入色譜純甲醇8mL，浸泡過夜，超聲提取2次，每次20min，定容搖勻，取上清液1mL，加入4mL水，全部轉(zhuǎn)移至MCI小柱(直徑：1.5cm，高度：2.0cm)，棄去洗脫液，再用3mL甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，定容至1mL，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.5 精密度試驗

取混合對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd色譜峰面積的RSD(n=6)分別為0.18%、0.20%、0.32%、0.67%、0.16%、0.77%、0.17%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0h、12h、24h、36h、48h進樣測定1次，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd色譜峰面積的RSD(n=6)分別為1.03%、0.47%、3.37%、0.96%、0.85%、0.34%、0.79%。結(jié)果表明，樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一份樣品，制備6份供試品溶液，得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd平均含量的RSD分別為1.76%、0.87%、3.93%、1.15%、1.07%、1.11%、1.46%。結(jié)果表明，方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的西洋參莖、葉粉末，精密稱定，添加一定量的人參皂苷對照品，按“2.4”項下制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，結(jié)果見表1。

表1加樣回收率

Table 1 Sample recovery rate (n=6)

2.9 樣品含量測定

取3份西洋參莖、葉樣品，分別按“2.4”項下方法制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下測定，結(jié)果見表2。

表2西洋參莖、葉7種人參皂苷含量(mg/g)

Table2contentofsevenGinsenosidesinLeavesandStemsofPanaxquinguefoliumL.

Rg1ReRb1RcRb2Rb3Rd13.518.870.582.156.8622.777.8724.018.480.571.995.1418.848.9031.746.310.642.495.8722.809.00

3 討論

本試驗中，樣品前處理過程采用MCI小柱發(fā)現(xiàn)，MCI去除葉綠素效果明顯，經(jīng)處理后樣品幾近無色，同時考察了洗脫液體積，發(fā)現(xiàn)3mL甲醇即可將樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd洗脫完全，回收率分別為97.04%、98.96%、97.99%、97.28%、99.27%、98.83%、97.53%。超高效液相色譜為目前最高效的色譜分析儀器，尚未見在西洋參莖、葉成分分析中得到應(yīng)用。本試驗建立了一種測定西洋參莖、葉中7種人參皂苷含量的快速測定方法，僅在13min內(nèi)完成測定，該方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，可用于西洋參莖、葉中人參皂苷含量的測定及質(zhì)量控制。

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