正交試驗(yàn)法優(yōu)選五味子種子中木脂素類成分提取工藝

高忠寶 竇志華 張 琳 安莉萍

1.江蘇省南京市江寧區(qū)陶吳社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，江蘇南京211151；2.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院，江蘇南通226006；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023

正交試驗(yàn)法優(yōu)選五味子種子中木脂素類成分提取工藝

高忠寶1竇志華2張 琳2安莉萍3

1.江蘇省南京市江寧區(qū)陶吳社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，江蘇南京211151；2.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院，江蘇南通226006；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023

目的優(yōu)選五味子種子中木脂素類成分提取工藝。方法紫外分光光度法測定總木脂素含量，以五味子總木脂素提取量為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)考察回流次數(shù)（1、2、3次）、回流時(shí)間（30、45、60min）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（75%、85%、95%）、乙醇用量（4、5、6倍量）對五味子總木脂素提取量的影響。結(jié)果濃度在0.438～8.760μg/mL范圍內(nèi)，五味子乙素的吸光度與濃度有良好的線性關(guān)系（r=0.9928）。優(yōu)選的工藝為5倍量95%乙醇，回流提取3次，每次60min。結(jié)論優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，可用于為五味子種子中木脂素類成分的提取。

五味子種子；總木脂素；提取工藝；正交試驗(yàn)

五味子習(xí)稱“北五味子”，是一味常用中藥，為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的作用，多用于久咳虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥狀[1]?，F(xiàn)代研究表明，五味子具有抗肝損傷、抗氧化、抗菌、抗病毒、促進(jìn)代謝、抗腫瘤等藥理作用[2-4]，五味子中含有的化學(xué)成分主要有木脂素類、萜類、多糖類及有機(jī)酸類等，其中木脂素類成分與抗肝損傷、抗氧化作用明顯相關(guān)[5-8]。20世紀(jì)70年代初，我國臨床研究中發(fā)現(xiàn)五味子能明顯降低肝炎患者血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，并開發(fā)出治療肝炎藥物聯(lián)苯雙酯，由此掀起了對五味子木脂素的研究熱潮[9]。五味子中的木脂素主要為聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素，又稱五味子類木脂素，其中五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素等含量較高[10]。本課題組先期研究發(fā)現(xiàn)，五味子中的木脂素類成分90%以上存在于種子中，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9，11]。對五味子藥材中木脂素類成分的提取工藝研究，目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道[12-18]，但未見五味子種子中該類成分提取工藝的相關(guān)報(bào)道。本研究以五味子種子中總木脂素提取量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選了五味子種子中木脂素類成分的提取工藝，為相關(guān)制劑生產(chǎn)及本課題下一步制備提取物給予大鼠灌胃采集含藥血清，采用血清藥理學(xué)與血清藥化學(xué)相結(jié)合的方法研究五味子類木脂素保肝活性及構(gòu)效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

756MC紫外-可見分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠），Sartorius BT 25 S型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

五味子乙素（批號1100765-200710，純度≥98%），購自中國食品藥品檢定研究院；五味子（批號130623），購自南通三越中藥飲片有限公司，經(jīng)南通市藥品檢驗(yàn)所龔旭東主任中藥師鑒定，為Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)；甲醇為色譜純，乙醇為工業(yè)乙醇。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材處理

稱取五味子藥材180 g，加適量水（水剛好將藥材淹沒即可），浸泡5 h，分離果皮和種子，45℃干燥24 h，干燥后將種子粉碎并過三號篩，存干燥器中備用。

2.2 五味子總木脂素含量測定方法的建立

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取五味子乙素對照品0.219 mg置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配制成濃度為0.219mg/mL的對照品儲(chǔ)備液，分別精密吸取對照品儲(chǔ)備溶液0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 m L，至5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成五味子乙素含量分別為0.438、1.752、3.504、5.256、7.008、8.760μg/mL的系列對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備各正交試驗(yàn)組提取液以4000 r/min離心10min，上清液置100 mL容量瓶中，用相同的溶劑定容至刻度，搖勻，精密吸取1～5mL容量瓶中，用相同的溶劑定容至刻度，搖勻，再從中精密吸取0.08 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察取6個(gè)濃度的對照品溶液，置石英皿中，紫外-可見分光光度計(jì)在254 nm下以甲醇空白溶液調(diào)零，在此波長處測定各溶液的吸收度，每份測3次，吸光度取均值，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=31.3751C+0.0105（r=0.9928），提示濃度在0.438～8.760μg/mL范圍內(nèi)，五味子乙素的吸光度與濃度有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn)取濃度為5.256μg/mL的對照品溶液連續(xù)測定6次，測得吸光度，計(jì)算其RSD為0.92%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)同一份供試品溶液分別在0、20、40、60、80、100min測定吸光度，計(jì)算其RSD為2.52%，表明供試液在100min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)取五味子種子粉末6份，采用95%乙醇濃度5倍量回流3次，每次30 min進(jìn)行提取，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，測定吸光度，每份測3次取均值，計(jì)算每份溶液總木脂素的含量，得RSD為2.02%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 回收率試驗(yàn)采用95%乙醇濃度5倍量回流3次，每次30 min進(jìn)行提取，按“2.2.2”項(xiàng)下方法定容至5 mL后，精密吸收0.04 mL 6份，分別置10mL容量瓶中，分別加入對照品儲(chǔ)備液50、60、70μL，每體積2份，測定吸光度，每份測3次取均值，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 樣品測定參照正交試驗(yàn)不同方案，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測定，根據(jù)五味子乙素回歸方程計(jì)算總木脂素提取量。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

以回流次數(shù)、回流時(shí)間、乙醇濃度和乙醇用量為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，稱取五味子種子粉末約5 g，共9份，選用L9（34）正交表安排試驗(yàn)。按“2.2”項(xiàng)下建立的方法測定各試驗(yàn)組總木脂素提取量，并對結(jié)果進(jìn)行直觀和方差分析。因素水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

從表3中極差可以看出，各因素對五味子種子中木脂素類成分提取率影響的大小順序?yàn)椋篈（回流次數(shù)）＞B（回流時(shí)間）＞D（乙醇用量）＞C（乙醇濃度），由表4方差分析結(jié)果可知，A因素（回流次數(shù)）對提取率有極顯著影響（P＜0.01），B因素（回流時(shí)間）有顯著影響（P＜0.05），C因素（乙醇濃度）、D因素（乙醇用量）對無明顯影響（P＞0.05）。從生產(chǎn)實(shí)際綜合考慮，確定最佳提取工藝為A3B3C3D2，即5倍量95%乙醇，回流提取3次，每次60 min。

2.4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取五味子種子粉末3份，每份50 g，按優(yōu)選的工藝條件提取，并測定總木脂素提取量，結(jié)果分別為39.317、37.453、43.167 mg/g，表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

表2 因素水平表

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

3 討論

五味子中木脂素類成分最常用的方法為溶劑提取法，且常用回流的方法提取[19]。木脂素親脂性強(qiáng)，用有機(jī)溶劑提取較好，王茹等[20]比較了甲醇、氯仿、乙醇、環(huán)己烷等對五味子乙素和五味子醇甲的提取效率，發(fā)現(xiàn)甲醇和乙醇提取效率較高，考慮到經(jīng)濟(jì)、安全、適宜工業(yè)化生產(chǎn)等因素，最終選擇用乙醇作為提取溶劑進(jìn)行工藝優(yōu)選。綜合以上分析，本研究選用乙醇采用回流提取法進(jìn)行提取工藝研究。

對于采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選五味子中木脂素類成分的提取工藝研究，以往的研究多以1個(gè)或幾個(gè)代表性木脂素提取量為考察指標(biāo)，如蔣益萍等[12]以五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素為考察指標(biāo)，肖建春等[14]以五味子醇甲和五味子乙素為考察指標(biāo)，俞金等[15]以五味子乙素為考察指標(biāo)，分別采用正交試驗(yàn)法考察了五味子藥材中木脂素類成分的提取工藝，結(jié)果均不一樣。迄今為止從五味子中分離得到的五味子類木脂素約50個(gè)[21]，單一指標(biāo)不能全面反映木脂素類成分的提取效率[12]。有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法，以總木脂素提取量為考察指標(biāo)，優(yōu)選了五味子種子中木脂素的提取工藝。

目前采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選的五味子中木脂素類成分提取工藝結(jié)果均不一樣，如蔣益萍等[12]優(yōu)選的工藝為8倍量95%乙醇回流提取2次，每次2 h；肖建春等[14]優(yōu)選的工藝為8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h；俞金等[15]優(yōu)選的工藝為6倍量85%乙醇回流提取3次，每次2 h。從本研究結(jié)果看，回流次數(shù)和回流時(shí)間的結(jié)果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇最優(yōu)的水平，乙醇濃度和用量對結(jié)果的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最終確定的工藝乙醇濃度選擇了最優(yōu)水平，對于乙醇用量，最優(yōu)的水平雖為水平1（4倍量），結(jié)合以上文獻(xiàn)研究結(jié)果，為保證提取完全，也考慮了節(jié)約成本，最終選擇了水平2，即5倍量。

五味子中總木脂素的含量測定方法主要有變色酸法和紫外分光光度法。變色酸法測定的是五味子類木脂素結(jié)構(gòu)中的亞甲二氧基（-OCH2O-）與Ecgrine試劑（變色酸濃硫酸試劑）反應(yīng)的甲醛，但五味子中含量較高的五味子醇甲、五味子甲素等不含有亞甲二氧基，并且在強(qiáng)酸作用下，一些含有呋喃環(huán)的木脂素成分會(huì)釋放出一定量的甲醛，對結(jié)果均會(huì)造成誤差[22]。紫外分光光度法易于操作，所以本研究采用該法測定五味子總木脂素的含量。紫外分光光度法根據(jù)溶劑的不同測定波長，甲醇作為溶劑時(shí)測定波長254 nm[23]，故選用254 nm作為測定波長。

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Optim ization of extraction technology for lignanoids from seed of Schisandra chinensis by orthogonal experiment

GAO Zhongbao1DOU Zhihua2ZHANG Lin2AN Liping3
1.Taowu Community Health Center in Jiangning District of Nanjing City,Jiangsu Province,Nanjing 211151,China; 2.Nantong Third Hospital Affiliated to Nantong University,Jiangsu Province,Nantong 226006,China;3.Nanjing University of Chinese Medicine,Jiangsu Province,Nanjing 210023,China

Objective To optimize extraction technology for lignans from seed of Schisandra chinensis.Methods The content of total lignans was determined by ultraviolet spectrophotometry.Total lignans was taken as evaluation index, L9(34)orthogonal design wasused to investigate the impacts ofnumber of times(1,2,3 times)and time of reflux(30,45, 60min),density(75%,85%,95%)and usage amount volume(4,5,6 times)of alcohol on the extraction capacity of total lignans.Results The linear range of schizandrin B waswithin 0.438-8.760μg/mL(r=0.9928).The preferred process was as follows:reflux three timeswith 5 times the amount of 95%alcohol,60 minutes each time.Conclusion This optimized extraction technology is stable and feasible,and can be used for extraction of lignanoids from seed of Schisandra chinensis.

Seed of Schisandra chinensis;Total lignans;Extraction technology;Orthogonal experiment

R284.2

A

1673-7210（2014）09（c）-0086-04

2014-06-09本文編輯：衛(wèi)軻）

江蘇省藥學(xué)會(huì)-施貴寶醫(yī)院藥學(xué)基金中標(biāo)課題（編號JS2012-04）；江蘇省南通市應(yīng)用研究科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號K2008027）。

高忠寶（1967-），男，江蘇南京人，副主任中藥師，主要從事藥品調(diào)劑及中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

竇志華（1966-），男，江蘇南通人，博士，主任中藥師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。