云南高海拔牧場(chǎng)牦牛捕食線蟲真菌生防高效菌株的篩選

舒凡帆，代 琦，蘇錫鈞，蘇子峰，蘇鴻雁

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

云南是我國牦牛生產(chǎn)的重要基地之一，牦牛是牛屬（Bosspp.）動(dòng)物中能適應(yīng)高寒氣候條件的特有種類，是唯一能夠充分利用高山牧場(chǎng)自然資源的牛種〔1〕。大理花甸壩牧場(chǎng)、中甸打日壩牧場(chǎng)、白馬雪山牧場(chǎng)牦牛養(yǎng)殖是當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民生產(chǎn)生活的源泉之一。近年來，由于草原放牧的牦牛與其他各種家畜交錯(cuò)放牧，接觸頻繁，致使牦牛感染寄生蟲病情況處于上升趨勢(shì)〔2〕。長(zhǎng)期以來，控制和預(yù)防牦牛消化道線蟲病主要以化學(xué)藥物為主，但藥物無節(jié)制的使用不僅易導(dǎo)致耐藥蟲株大量產(chǎn)生，而且會(huì)造成藥物殘留在畜產(chǎn)品中的食品衛(wèi)生安全問題。用化學(xué)藥物進(jìn)行線蟲病防治副作用較大，如蟲體抗藥性問題、藥物殘留及藥物代謝產(chǎn)物影響生態(tài)環(huán)境等問題，而且絕大多數(shù)化學(xué)藥物僅對(duì)成蟲起作用，對(duì)蟲卵及幼蟲無能為力。因此，人們一直在尋求新的防治方法〔3〕。

捕食線蟲真菌（nematode-trapping fungi）是線蟲重要的天敵之一，且廣泛存在于自然界中，其通過菌絲特化形成各種捕食結(jié)構(gòu)捕食線蟲，是目前研發(fā)寄生線蟲生防制劑的重要資源〔4〕。其特點(diǎn)是在線蟲幼蟲感染動(dòng)物之前將其殺死，避免家畜的感染或重復(fù)感染〔5〕。國外畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國家，如新西蘭、澳大利亞等，已成功將捕食線蟲真菌開發(fā)成生防制劑，并成功應(yīng)用于家畜寄生線蟲病的防治〔6-7〕。國內(nèi)許多學(xué)者在這一領(lǐng)域也取得了顯著的成果〔8-10〕。

然而，對(duì)于特定牧區(qū)寄生線蟲的生物防治，土著生防菌因長(zhǎng)期適合本地區(qū)自然環(huán)境條件而成為首選的評(píng)估資源，該類生防菌不僅需具有抗消化的能力，還需具有較強(qiáng)的捕食活力〔11〕。通過前期對(duì)云南3 個(gè)高原牧場(chǎng)：大理花甸壩牧場(chǎng)、中甸打日壩牧場(chǎng)、白馬雪山牧場(chǎng)捕食線蟲真菌資源的初步調(diào)查，已獲得40株捕食線蟲真菌。本實(shí)驗(yàn)擬從中選出12株捕食線蟲真菌做體外抗消化試驗(yàn)并測(cè)定捕食率，擬篩選出具有抗消化能力且捕食活力較高的生防菌株，以期為牦牛及其它動(dòng)物線蟲病的生物防治提供捕食線蟲真菌菌種資源。

1 材料和方法

1.1 供試菌由大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離于云南大理花甸壩，中甸打日壩牧場(chǎng)及白馬雪山牧場(chǎng)新鮮耗牛糞便〔12-13〕，共12株捕食線蟲真菌，包括3株少孢節(jié)叢孢（A.oligospora）、3株彎孢節(jié)叢孢（A. musiformis），3 株橢圓隔指孢（D. ellipsospora）及3 株長(zhǎng)孢隔指孢（D. leptospora）。見表1。

表1 抗鹽酸胃蛋白酶的捕食線蟲真菌篩選結(jié)果

1.2 線蟲秀麗隱桿線蟲（Paragrellus redivius）：參照文獻(xiàn)〔14〕方法制備新鮮有活力的第三期線蟲幼蟲，用無菌水將其制成每100 μL約含50條線蟲幼蟲懸液。

1.3 培養(yǎng)基CMA（玉米粉瓊脂）：參照文獻(xiàn)〔15〕方法制備0.4 g/L玉米粉瓊脂培養(yǎng)基。

1.4 鹽酸-胃蛋白液胃蛋白酶按1%（W/V）的濃度配制，然后用10%的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2.5，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 抗鹽酸-胃蛋白酶試驗(yàn)將12 株供試菌株分生孢子分別加入39 ℃預(yù)熱的鹽酸-胃蛋白酶溶液離心管中，混勻后置于39 ℃培養(yǎng)箱作用4 h。分別取少量溶液接種于CMA 培養(yǎng)基，置25 ℃溫箱中培養(yǎng)7 d 后，在超凈工作臺(tái)上用體視鏡觀察是否有目標(biāo)菌的生長(zhǎng)，向生長(zhǎng)的菌株中加入第三期幼蟲，培養(yǎng)24 h后觀察捕食器官形態(tài)結(jié)構(gòu)，以確認(rèn)并篩選目標(biāo)耐受菌株。

1.6 耐受菌株捕食器官產(chǎn)生數(shù)量比較根據(jù)“1.1”試驗(yàn)的結(jié)果，比較耐受鹽酸-胃蛋白酶溶液的捕食線蟲真菌捕食器官產(chǎn)生數(shù)量的情況。將耐受菌株接種于CMA培養(yǎng)基中央，設(shè)立不接種菌株的空白對(duì)照組，在25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后，向其中加入第三期幼蟲溶液200 μL。試驗(yàn)分7組，每組3個(gè)培養(yǎng)皿，分別在5、10、15、20、25、30、35 ℃條件下培養(yǎng)，24 h 后觀察捕食器官產(chǎn)生情況：在培養(yǎng)皿中隨機(jī)取20個(gè)直徑為5 mm 的圓形區(qū)域，在體視鏡下測(cè)其捕食器官數(shù)，計(jì)算出捕食器官數(shù)/cm2。采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同溫度下菌株產(chǎn)生的捕食器官數(shù)進(jìn)行方差分析，其中，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 耐受菌株捕食線蟲活性比較根據(jù)“1.1”、“1.2”試驗(yàn)結(jié)果，比較最適溫度下，耐受鹽酸-胃蛋白酶溶液的捕食線蟲真菌捕食活性情況。將耐受菌株接種于CMA 培養(yǎng)基中央，每株接種3 個(gè)培養(yǎng)皿，設(shè)立不接種菌株的空白對(duì)照組，在25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后，向其中加入第三期幼蟲溶液200 μL，在25 ℃條件下培養(yǎng)，24 h后在培養(yǎng)皿中隨機(jī)取10個(gè)直徑為5 mm的圓型區(qū)域，在體視鏡下觀察記錄真菌對(duì)線蟲幼蟲的捕食情況，按公式計(jì)算出菌株捕食線蟲活性即捕食率（%）。捕食率（P）=被捕獲的蟲體數(shù)（X）/〔X+自由活動(dòng)蟲體數(shù)（Y）〕×100%。

2 結(jié)果

2.1 抗鹽酸-胃蛋白酶試驗(yàn)12個(gè)供試菌株中6個(gè)菌株通過了鹽酸-胃蛋白酶處理，總通過率50.00%，其中A. oligospora，A. musiformis，D. ellipsospora，D.leptospora通過率分別為66.66%、66.66%、33.33%、33.33%。結(jié)果：從12株菌株中成功篩選到6株耐鹽酸-胃蛋白酶的捕食線蟲真菌。見表1。

2.2 耐受菌株捕食器官產(chǎn)生數(shù)量比較在5～35 ℃之間，A.oligospora、A.musiformis的 4 株耐受菌株均能產(chǎn)生不同數(shù)量的捕食器官，而D.leptospora、D.ellipsospora的2株耐受菌株在5 ℃以下或35 ℃以上不產(chǎn)生捕食器官。另外，在25 ℃條件下，各耐受菌株產(chǎn)生的捕食器官數(shù)最多，與其它溫度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），相對(duì)而言，在25 ℃條件下，A.oligospora的Ao-HDB、Ao-DRB及D.ellipsospora的De-BMXS 產(chǎn)生的捕食器官數(shù)較A. musiformis的Am-HDB、Am-DRB 和D. leptospora的 Dl-DRB 高（P＜0.05）。結(jié)果表明，25 ℃條件下6株耐受菌株均能產(chǎn)生較多的捕食器官，其中A.oligospora的2株及D.ellipsospora的1株耐受菌產(chǎn)生捕食器官的能力相對(duì)較強(qiáng)。見表2。

表2 耐受菌株在不同溫度下產(chǎn)生的捕食器官數(shù)量比較

2.3 耐受菌株捕食線蟲活性比較6 株耐受菌捕食率在23.40%～77.77%之間，均顯示出一定的捕食活性。其中，A. oligospora的 Ao-HDB、Ao-DRB 及D. ellipsospora的 De-BMXS 捕食率較高，分別為77.77%、70.52%、68.81%；其次為A. musiformis的Am-HDB、Am-DRB，捕食率分別為53.84%、47.12%；最低的是D.leptospora的Dl-DRB，僅有23.40%。結(jié)果再次表明，6 株耐受菌中A. oligospora的2 株及D.ellipsospora的1株耐受菌的捕食線蟲活性相對(duì)較強(qiáng)。見表3。

表3 耐受菌株25 ℃條件下捕食活性比較

3 討論

在動(dòng)物生防控制中，通過將捕食線蟲真菌加入飼料使之出現(xiàn)在糞便，用以捕捉糞便中的線蟲幼蟲是防治動(dòng)物線蟲病理想的方法，因此用于生物防治的捕食線蟲真菌需具有一定的抗消化能力〔16〕。有研究表明大多數(shù)捕食線蟲真菌由于不能耐受瘤胃液和真胃中的鹽酸胃蛋白酶液作用，因而在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體外抗消化篩選可快速得到耐消化的捕食線蟲真菌〔11，17〕。根據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果，12株云南高海拔牧場(chǎng)牦牛糞便中的捕食線蟲真菌中有6株通過鹽酸胃蛋白酶處理，通過率50.00%。

捕食線蟲真菌在營養(yǎng)貧瘠的環(huán)境中若存在新鮮幼蟲，真菌很快就會(huì)形成捕食器官捕食幼蟲以補(bǔ)充營養(yǎng)來源的不足〔18〕。本實(shí)驗(yàn)在5～35 ℃之間，加入幼蟲后，6 株耐受菌在20、25 ℃時(shí)產(chǎn)生的捕食器官最多，這與楊曉野等〔19〕已有研究基本一致，只是A.oligospora產(chǎn)生的捕食器官數(shù)略高于D.ellipsospora，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與菌株來源于高海拔牧場(chǎng)有一定的關(guān)系。根據(jù)產(chǎn)生捕食器官的數(shù)量，我們從6株耐受菌株中初步篩選出Ao-HDB、Ao-DRB 及De-BMXS 3 株產(chǎn)生捕食器官的能力相對(duì)較強(qiáng)的菌株。

由于捕食線蟲真菌主要作用于寄生線蟲在環(huán)境中的自由生活階段。因此，對(duì)真菌體外捕食線蟲效力的測(cè)定能為其防治線蟲效果提供重要參考依據(jù)〔15〕。孟慶玲等〔18〕對(duì)A.oligospora新疆分離株的捕食活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明菌株在CMA培養(yǎng)基上捕食率達(dá)到92.8%～97.6%。楊曉野等〔19〕對(duì)A. oligospora和D.ellipsospora的捕食效力進(jìn)行研究，結(jié)果表明菌株在CMA 培養(yǎng)基上捕食率達(dá)到78.2%和80.1%。本研究中3 株產(chǎn)生捕食器官數(shù)量較多的耐受菌Ao-HDB、Ao-DRB及De-BMXS捕食率分別為77.77%、70.52%、68.81%，也表現(xiàn)出較強(qiáng)的捕食線蟲活性。

同一捕食線蟲真菌在不同的地區(qū)可能存在著菌株的差異，云南高海拔牧場(chǎng)獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件使得捕食線蟲性真菌云南分離到的菌株生物學(xué)特性和捕食能力與其它地區(qū)分離到的菌株有所不同，因此篩選出本地自然環(huán)境條件下適應(yīng)本地氣候、生態(tài)環(huán)境和動(dòng)物飼養(yǎng)管理?xiàng)l件的菌株尤為重要。本研究篩選到了3株能耐受鹽酸胃蛋白酶液作用且具有較強(qiáng)捕食活性的捕食線蟲真菌，可為研制適合于云南高原牧場(chǎng)牦牛及其它動(dòng)物線蟲病高效生物防治菌劑提供菌種資源。但該3株捕食線蟲真菌是在實(shí)驗(yàn)室條件下篩選到的，是否能正常通過動(dòng)物體內(nèi)的消化液，并在外界保持有效地捕食活力還有待進(jìn)一步研究。

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