宋紹萍,楊國(guó)輝
(大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,云南大理 671003)
血液是動(dòng)物體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中重要的組成部分,血細(xì)胞的形態(tài)及組成具有一定的特異性,可作為反映物種特性及生理狀態(tài)的指標(biāo),同時(shí)也為動(dòng)物的分類、生理及系統(tǒng)演化等提供重要依據(jù)。為此,許多學(xué)者對(duì)脊椎動(dòng)物血細(xì)胞進(jìn)行過研究〔1-8〕,對(duì)于兩棲類,至今已經(jīng)完成十多種動(dòng)物的血液組織學(xué)研究。紅瘰疣螈Tylototriton shanjingNussbaum,BrodieetYang 1995 屬于兩棲綱,有尾目,蠑螈科,疣螈屬的一類國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物〔9〕,目前有關(guān)紅瘰疣螈的研究主要集中在繁殖、生態(tài)、染色體、皮膚結(jié)構(gòu)及幼體形態(tài)發(fā)育等方面〔10-14〕,而有關(guān)紅瘰疣螈血細(xì)胞組織學(xué)的研究尚未見報(bào)道。本研究采用傳統(tǒng)的常規(guī)血涂片,姬姆薩(Giemsa)染色與血細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察并統(tǒng)計(jì)紅瘰疣螈全血細(xì)胞的形態(tài)特征及其數(shù)量比例,旨在為紅瘰疣螈的血液形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫以及進(jìn)化等方面的研究提供理論依據(jù)。
1.1 材料實(shí)驗(yàn)用紅瘰疣螈6 只均采自云南大理點(diǎn)蒼山地區(qū),海拔1 800~2 300 m 之間,經(jīng)模擬野外環(huán)境進(jìn)行人工養(yǎng)殖7~350 d不等。見表1。
表1 紅瘰疣螈標(biāo)本的測(cè)量值
1.2 方法乙醚麻醉后自心臟取血,制成血涂片,瑞氏-姬姆薩染色,奧林帕斯顯微鏡(BX51)成像系統(tǒng)觀察、拍照、測(cè)量,每個(gè)樣本統(tǒng)計(jì)5 片。細(xì)胞的大小取30 個(gè)細(xì)胞的平均值,血細(xì)胞計(jì)數(shù)用Neubauer計(jì)數(shù)板進(jìn)行。白細(xì)胞比例的計(jì)算,取不重復(fù)視野中1 000個(gè)白細(xì)胞的記數(shù),再算出百分比。
2.1 血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)對(duì)6個(gè)紅瘰疣螈個(gè)體,分別制作血涂片,對(duì)不同的個(gè)體進(jìn)行血細(xì)胞分類計(jì)數(shù),再算出平均數(shù),結(jié)果見表2~3。結(jié)果顯示:紅細(xì)胞數(shù)量為1.48×105個(gè)/mm3,白細(xì)胞數(shù)量為0.17×105個(gè)/mm3,其中淋巴細(xì)胞占43%,單核細(xì)胞數(shù)占14%,中性粒細(xì)胞占19%,嗜酸性粒細(xì)胞占16%,嗜堿性粒細(xì)胞占8%。
表2 紅瘰疣螈6個(gè)個(gè)體紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞參數(shù)
表3 紅瘰疣螈6個(gè)個(gè)體嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞參數(shù)
2.2 血細(xì)胞的形態(tài)及大小通過顯微鏡觀察,紅瘰疣螈中橢圓形的紅細(xì)胞較多,占90%以上,白細(xì)胞近圓形,常單個(gè)分散或多個(gè)聚集于紅細(xì)胞間。
2.2.1 紅細(xì)胞 對(duì)6只紅瘰疣螈外周血中的紅細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量,得出平均值,其紅細(xì)胞長(zhǎng)徑為(28.71±2.31)μm、短徑(15.92±1.22)μm、細(xì)胞核長(zhǎng)(10.17±0.89)μm、短徑(6.11±0.49)μm。成熟紅細(xì)胞表面光滑,有核,多數(shù)為橢圓形,少數(shù)梨形;除成熟紅細(xì)胞外,偶爾可見少量未成熟紅細(xì)胞、無核紅細(xì)胞和衰老的紅細(xì)胞。見圖1。與成熟紅細(xì)胞相比,未成熟紅細(xì)胞體積稍小,近圓形,核質(zhì)比較大,核圓形,染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較疏松,著色較淺,而衰老紅細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)有顆粒狀物質(zhì),細(xì)胞核固縮,核結(jié)構(gòu)模糊不清,染色加深;無核紅細(xì)胞的質(zhì)著色較淺。
圖1 紅瘰疣螈血細(xì)胞形態(tài)
2.2.2 白細(xì)胞 白細(xì)胞多近圓形,根據(jù)其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有無特殊顆??煞譃橛辛0准?xì)胞和無粒白細(xì)胞。有粒白細(xì)胞根據(jù)其嗜色性可分為嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。無粒白細(xì)胞則包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞,各種細(xì)胞的大小見表4。
表4 紅瘰疣螈白細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)(±s,μm)
表4 紅瘰疣螈白細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)(±s,μm)
項(xiàng)目細(xì)胞長(zhǎng)徑細(xì)胞短徑嗜中性粒細(xì)胞27.27±1.92 23.53±2.50嗜酸性粒細(xì)胞27.15±0.91 26.27±0.83嗜堿性粒細(xì)胞25.58±2.94 23.51±3.71單核細(xì)胞26.58±3.17 23.52±3.72淋巴細(xì)胞14.79±0.69 12.11±0.93
根據(jù)圖1 可看出,嗜中性粒細(xì)胞多呈近圓形或馬蹄形,也有少量呈不規(guī)則形。核質(zhì)之間明顯,細(xì)胞核較大,核有單葉核和分葉核,單葉核呈腎形、馬蹄形和半圓形,分葉核多為2~3 葉,少數(shù)為4~6 葉。嗜酸性粒細(xì)胞呈近圓形,細(xì)胞核常橢圓形,位于一側(cè),細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色。嗜堿性細(xì)胞呈近圓形,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒較分散,被染成深紫藍(lán)色。淋巴細(xì)胞多成近圓形,細(xì)胞核位于細(xì)胞中央,所占比例很大,淋巴細(xì)胞的核被染成深藍(lán)色,胞質(zhì)少且被染成淺藍(lán)色。單核細(xì)胞多呈近圓形,細(xì)胞核較大,核多馬蹄形或腎形,位于細(xì)胞中央,被染成藍(lán)紫色。細(xì)胞質(zhì)被染成淡灰藍(lán)色。血栓細(xì)胞多數(shù)呈不規(guī)則形,常數(shù)個(gè)聚在一起,也偶有單個(gè)分散或3~4個(gè)連在一起,呈帶狀。細(xì)胞核較大,被染成深藍(lán)色。細(xì)胞質(zhì)較少,呈淺藍(lán)色。
紅瘰疣螈和其他兩棲類一樣,外周血中含有紅細(xì)胞和白細(xì)胞,但其數(shù)量和大小與其他兩棲類動(dòng)物有明顯差異,在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)6 個(gè)個(gè)體間血細(xì)胞參數(shù)沒有明顯差異。見表2。人工飼養(yǎng)對(duì)其血細(xì)胞參數(shù)是否有影響還有待于進(jìn)一步的研究。
3.1 紅細(xì)胞紅細(xì)胞是脊椎動(dòng)物血液的主要有形成分,在機(jī)體內(nèi)主要運(yùn)輸O2和CO2,并對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的酸、堿物質(zhì)起緩沖作用,維持一定的酸堿平衡。動(dòng)物紅細(xì)胞的形態(tài)、大小、數(shù)量與動(dòng)物的進(jìn)化和生態(tài)適應(yīng)有一定的關(guān)系,動(dòng)物越高等,紅細(xì)胞的數(shù)量越多,而體積越小。就兩棲綱而言,紅瘰疣螈的橢圓形紅細(xì)胞大?。?8.71±2.31)μm×(15.92±1.22)μm,介于無足目的版納魚螈Ichthyophis bannanica(32.30±5.08)μm×(18.17±2.71)μm 和無尾目中華蟾蜍Bufo gargarizans(15.48~21.94)μm×(10.32~14.19)μm 之間,在蠑螈科中紅瘰疣螈的橢圓形紅細(xì)胞又大于東方蠑螈Cynops orientalis(22.4×14.8)μm,表明紅瘰疣螈所屬的有尾目進(jìn)化地位處于無足目和無尾目之間,所屬的疣螈屬比蠑螈屬低等,符合分子研究結(jié)果〔15〕。紅瘰疣螈紅細(xì)胞數(shù)量(1.48×105個(gè)/mm3)均低于中華蟾蜍(7.67×105個(gè)/mm3)和藍(lán)尾蠑螈Cynops cyanurus(7.74×105個(gè)/mm3),這可能與紅瘰疣螈行動(dòng)緩慢、運(yùn)動(dòng)量小,代謝率較低等生活習(xí)性有關(guān)。
觀察紅瘰疣螈血涂片紅細(xì)胞時(shí),還觀察到無核紅細(xì)胞和梨形紅細(xì)胞,無核紅細(xì)胞染色與紅細(xì)胞一致,認(rèn)為無核紅細(xì)胞屬于血液中正常有形成分,可能是其原生質(zhì)的脫水收縮,細(xì)胞核固縮,是細(xì)胞衰老的表現(xiàn)。梨形紅細(xì)胞的染色、結(jié)構(gòu)與橢圓形紅細(xì)胞一致,也屬于血液中正常有形成分,在北方山溪鯢、黑斑蛙和新疆北鯢外周血細(xì)胞觀察中也發(fā)現(xiàn)有梨形紅細(xì)胞,估計(jì)這是由未成熟紅細(xì)胞直接分裂形成的,是兩棲類紅細(xì)胞的增殖補(bǔ)充的一種方式〔16〕,究竟什么原因引起未成熟紅細(xì)胞的直接分裂,還有待于進(jìn)一步研究。
3.2 白細(xì)胞白細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體防御和保護(hù)功能的重要組成成分,不同動(dòng)物的各種白細(xì)胞的組成比例、大小有差異。就兩棲類而言,紅瘰疣螈外周血液中白細(xì)胞數(shù)量最多的是淋巴細(xì)胞,占43%,與其他兩棲綱動(dòng)物一致,這可能與兩棲類的生境有關(guān),一般兩棲類生活在清澈的山間溪流中,對(duì)水質(zhì)要求較高,而淋巴細(xì)胞是機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的主要物質(zhì),所以在兩棲類外周血中白細(xì)胞數(shù)量最多的是淋巴細(xì)胞。
嗜中性粒細(xì)胞具有活躍的變形能力,高度的趨化性和很強(qiáng)的吞噬及消化細(xì)菌的能力,是吞噬外來微生物和異物的主要成分。紅瘰疣螈白細(xì)胞中嗜中性粒細(xì)胞含量(19%)與同科的東方蠑螈(22%)和藍(lán)尾蠑螈(20%)相似,與無足目的版納魚螈(15%)、有尾目的新疆北鯢(19%)與商城肥鯢(12%)和牛蛙(19%)接近,但與東北小鯢(1%)、北方山溪鯢(9%)、黑龍江林蛙(1%)差異較大,推斷這可能與兩棲動(dòng)物生活習(xí)性、環(huán)境有關(guān),不存在科屬間的差異。
嗜堿性粒細(xì)胞不具有吞噬能力,但可增加毛細(xì)血管通透性和釋放肝素、組胺等多種生物活性物質(zhì)。在不同的脊椎動(dòng)物中其含量存在明顯的差異,對(duì)于兩棲類動(dòng)物它在白細(xì)胞中含量最少,紅瘰疣螈白細(xì)胞中僅占8%,新疆北鯢(1%)、東北小鯢(3%)、商城肥鯢(8%)、北方山溪鯢(6%),而有的種血液中就沒有嗜堿性粒細(xì)胞,如已經(jīng)報(bào)道的東方蠑螈、藍(lán)尾蠑螈、黑龍江林蛙、東北林蛙,而有的含量又很高如版納魚螈(11%),究其原因,目前還不清楚,有待于進(jìn)一步的探討〔17-22〕。
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