藜蘆堿對HepG2細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制

劉蒼龍，王宇光，馬增春，梁乾德，肖成榮，譚洪玲，湯響林，高 月

（1．廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530000；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室，北京100850）

LIU Cang-long1，2，WANG Yu-guang2，MA Zeng-chun2，LIANG Qian-de2，XIAO Cheng-rong2，TAN Hong-ling2，TANG Xiang-lin2，GAO Yue2

（1．Schoo l o f Pharm acy，GuangxiMedica l University，Nanning 530000，China；2．Departm ent o f Pharm acoloyg and Toxico logy，Institute o f Radiation Medicine，Academ y of M ilitary Medica l Sciences，Beijing 100850，China）

藜蘆堿對HepG2細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制

劉蒼龍1，2，王宇光2，馬增春2，梁乾德2，肖成榮2，譚洪玲2，湯響林2，高 月2

（1．廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530000；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室，北京100850）

目的研究藜蘆堿對人肝癌HepG2的細(xì)胞毒作用及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為開發(fā)安全有效的臨床用藥提供依據(jù)。方法藜蘆堿0．1～0．6 g·L－1作用于HepG2細(xì)胞24 h，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率并計(jì)算IC50值；藜蘆堿0．1～0．5 g·L－1作用于HepG2細(xì)胞24 h，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞膜損傷；流式細(xì)胞儀檢測活性氧（ROS）的生成量、線粒體膜電位的變化以及細(xì)胞凋亡的變化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因p53、Bax、細(xì)胞色素c、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3 m RNA表達(dá)。結(jié)果藜蘆堿0．1～0．6 g·L－1作用于HepG2細(xì)胞可以顯著抑制細(xì)胞活性（P＜0．05，P＜0．01），IC50值為0．4 g·L－1，95%的可信限為0．2558～0．6965 g·L－1。藜蘆堿0．1，0．2，0．3，0．4和0．5 g·L－1給藥組，與正常對照組相比，LDH釋放量顯著升高（P＜0．05，P＜0．01），ROS的生成量顯著增大（P＜0．05，P＜0．01），線粒體膜電位顯著降低（P＜0．05，P＜0．01），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0．05，P＜0．01）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測顯示，凋亡相關(guān)基因p53、Bax、細(xì)胞色素c、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3 m RNA表達(dá)升高（P＜0．05，P＜0．01）。結(jié)論藜蘆堿具有潛在的細(xì)胞毒性，能抑制HepG2細(xì)胞增殖，損傷細(xì)胞膜和線粒體進(jìn)而啟動(dòng)凋亡基因胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)，這可能是其最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

藜蘆堿；HepG2細(xì)胞；毒性作用

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．014

藜蘆為百合科藜蘆屬植物，全株有毒，根和根莖毒性最強(qiáng)，藜蘆的毒素主要是其所含有的生物堿類，藜蘆堿（veratrine）對神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)都有一定的毒性作用，引發(fā)痙攣、抽搐、昏迷，導(dǎo)致呼吸暫停，誘發(fā)心律失常，引起流涎、惡心、腹瀉導(dǎo)致胚胎畸形［1］。還有報(bào)道，將藜蘆堿作為外用藥治療疥瘡，除螨取得了良好的效果［2］。藜蘆堿能有效殺死幽門螺桿菌，在治療幽門螺桿菌引起的的胃潰瘍上有廣闊的應(yīng)用前景［3］。由于其治療用量和中毒劑量非常接近，因此限制了藜蘆在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用，如能對藜蘆生物堿的毒性機(jī)制進(jìn)行深入研究，明確其藥理毒理作用的分子機(jī)制，就能趨利避害，為開發(fā)臨床安全有效的藥物提供重要的依據(jù)。

HepG2細(xì)胞來源于人類胚胎細(xì)胞瘤，所含生物轉(zhuǎn)化代謝Ⅰ相和Ⅱ相酶，用于體外遺傳毒性研究時(shí)，無需依賴外源性活化系統(tǒng)的加入，且該細(xì)胞分化程度較高，保留了人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的許多特點(diǎn)和功能，含有大量線粒體，被認(rèn)為是檢測外來化合物毒性的一個(gè)理想細(xì)胞系［4］。本研究選用HepG2細(xì)胞，研究藜蘆堿對人肝癌HepG2的細(xì)胞毒性作用及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 藥品、細(xì)胞、試劑和儀器

藜蘆堿購于美國Sigma公司，為藜蘆生物堿混合物，含有藜蘆定、瑟瓦狄靈、沙巴丁和鹽酸藜蘆堿，溶于水，可用培養(yǎng)基溶解。HepG2細(xì)胞系購于協(xié)和細(xì)胞庫中心。DMEM、胎牛血清（feta l bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素和鏈霉素均購于美國Gibco BRL公司；氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）購于上海旭東海普藥業(yè)公司；CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性定量測定試劑盒和活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒均購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購于碧云天生物技術(shù)研究所；AnnexinⅤ-FITC／PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于寶賽生物技術(shù)公司；Trizol購于美國Sigm a公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒和SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購于中國TransGen Biotech；PCR引物（表1）由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

FC500MCL型流式細(xì)胞儀，M icro fuge 22R型離心機(jī)，美國Beckman公司；Axiovert200熒光分析顯微鏡，德國ZEISS公司；GeneAm p PCR System 2400型PCR儀，美國App lied Biosystem公司；VICTOR X型多標(biāo)記酶標(biāo)儀，美國Perkin Elmer公司；Nanovue型超微量分光光度計(jì)，英國GE公司。

Tab．1 Prim ers used w ith real-time PCR

1．2 人肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2細(xì)胞株為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)于含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞長至80%左右時(shí)，用0．25%胰酶消化，置于5%的CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中，平均2～3 d傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．3 細(xì)胞形態(tài)的觀察

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)24 h，待HepG2細(xì)胞貼壁后棄去上清培養(yǎng)液，洗去未貼壁細(xì)胞。將藜蘆堿以終濃度0．1，0．2，0．3，0．4和0．5 g·L－1加入貼壁的HepG2細(xì)胞中培養(yǎng)24 h，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1．4 CCK-8檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用0．25%胰酶消化，吸管反復(fù)輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配成1．5×107L－1的細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞接種于96孔板每孔200μL，實(shí)驗(yàn)組設(shè)細(xì)胞對照孔和實(shí)驗(yàn)孔，并設(shè)調(diào)零孔（空白培養(yǎng)基，不加細(xì)胞）每組設(shè)5復(fù)孔。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待HepG2細(xì)胞貼壁且單層細(xì)胞鋪滿孔底后棄去上清培養(yǎng)液，洗去未貼壁細(xì)胞。將藜蘆堿分別以終濃度為0．1，0．15，0．2，0．25，0．3，0．35，0．4，0．45，0．5，0．55和0．6 g·L－1加入貼壁的HepG2細(xì)胞中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 m in，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值。

1．5 乳酸脫氫酶活性測定

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用0．25%胰酶消化，吸管反復(fù)輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配成1．5×107L－1的細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞接種于96孔板每孔200μL，實(shí)驗(yàn)組設(shè)細(xì)胞對照孔和實(shí)驗(yàn)孔，并設(shè)調(diào)零孔（空白培養(yǎng)基，不加細(xì)胞）每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待HepG2細(xì)胞貼壁且單層細(xì)胞鋪滿孔底后棄去上清培養(yǎng)液，洗去未貼壁細(xì)胞。將藜蘆堿以終濃度0．1，0．2，0．3，0．4和0．5 g·L－1加入貼壁的HepG2細(xì)胞中培養(yǎng)24 h后，取上清10μL，根據(jù)LDH試劑盒說明進(jìn)行操作。

1．6 細(xì)胞凋亡的檢測

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞6孔板培養(yǎng)，棄去上清培養(yǎng)液，洗去未貼壁細(xì)胞。將藜蘆堿以終濃度0．1，0．2，0．3，0．4和0．5 g·L－1置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3復(fù)孔，按照AnnexinⅤ-FITC／PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，置于流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)行定量分析。AnnexinⅤ-FITC和PI的激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長為530 nm。

1．7 活性氧濃度的檢測

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞6孔板培養(yǎng)，按照1．6項(xiàng)處理，同時(shí)增加試劑盒中H2O2100μmo l·L－1為陽性對照組，按照ROS檢測試劑盒，置于流式細(xì)胞儀，激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長為530 nm，測量熒光強(qiáng)度。

1．8 線粒體膜電位的檢測

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)24 h，按1．6項(xiàng)處理細(xì)胞，同時(shí)增加試劑盒中羥基氰化物間氯苯腙100μmol·L－1為陽性對照組，按照線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）說明書進(jìn)行，置于流式細(xì)胞儀上檢測，激發(fā)光波長為525 nm，發(fā)射光波長為595 nm，測定熒光強(qiáng)度。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物而產(chǎn)生紅色熒光，在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能形成聚合物，以單體的形式存在，而產(chǎn)生綠色熒光。用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體膜電位的變化程度。

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，6孔板培養(yǎng)，按1．6項(xiàng)進(jìn)行分組處理，同時(shí)增加5-FU 20 mg·L－1為陽性對照組。Trizol提取RNA，測定濃度后分裝，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，PCR反應(yīng)條件為94℃30 s，隨后94℃5 s，60℃30 s，95℃15 s，共40個(gè)循環(huán)。以各目標(biāo)基因2－△△Ct值表示各目標(biāo)基因mRNA相對表達(dá)水平。

1．10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 藜蘆堿對HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組HepG2細(xì)胞密度大，細(xì)胞邊緣光滑清晰而且貼壁性好（圖1A）；藜蘆堿0．1，0．2，0．3，0．4和0．5 g·L－1給藥24 h后，細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生明顯變化，藜蘆堿0．3～0．5 g·L－1，細(xì)胞體積縮小、褶皺，細(xì)胞邊界模糊不清，折光性差，胞漿顆粒增多，細(xì)胞密度明顯降低，出現(xiàn)壞死細(xì)胞（圖1D～F）。

Fig．1 Effec t o f veratrine hyd roch lo ride（VH）on cell im ages in HepG2 cells（×200）．The cells were cultured w ith VH for24 h．A：normalcontrol；B－F：VH 0．1，0．2，03，0．4 and 0．5 g·L－1，respectively．The arrow s show injured cells．

2．2 藜蘆堿對HepG2細(xì)胞存活率的影響

CCK-8法分析結(jié)果顯示，藜蘆堿0．1，0．2，0．3，0．4和0．5 g·L－1給藥24 h后，正常對照組存活率為100%，隨著藜蘆堿濃度的增加，HepG2細(xì)胞的存活率逐漸降低，顯示藜蘆堿對細(xì)胞存活的抑制作用具有一定的量效關(guān)系（r＝－0．9841，P＜0．05）（圖2），IC50為0．4 g·L－1，95%的可信限0．2558～0．6965 g·L－1。

Fig．2 Effect o f VH on cell viability o f HepG2 cells by CCK-8 assay．HepG2 cells were cultured w ith VH for24 h．Cell viability（%）＝A450nmof drug group／A450nmof control group× 100%．，n＝5．*P＜0．05，**P＜0．01，compared w ith normal control．

2．3 藜蘆堿對HepG2細(xì)胞LDH活性的影響

通過產(chǎn)教融合模式可幫助職業(yè)院校提高教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)出更多的高素質(zhì)實(shí)用型人才，從而促進(jìn)雙方在有合作共性的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)互利互補(bǔ)，協(xié)同高效發(fā)展。

由圖3可以看出，與正常對照組比較，藜蘆堿作用于HepG2細(xì)胞后可引起細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性升高（P＜0．05，P＜0．01），表明藜蘆堿在此濃度范圍內(nèi)作用于HepG2細(xì)胞后可引起細(xì)胞膜損傷，對HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性作用。

Fig．3 Effect o f VH on lactate dehyd rogenase（LDH）release o f HepG2 cells．HepG2 cells were incubated w ith VH for24 h．，n＝5．*P＜0．05，**P＜0．01，com pared w ith normal control．

2．4 藜蘆堿對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

藜蘆堿對HepG2細(xì)胞凋亡的影響如圖4所示，與正常對照組比較，藜蘆堿0．1，0．2，0．3，0．4和0．5 g·L－1處理HepG2細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率逐漸升高（P＜0．05，P＜0．01）（表2）。

Fig．4 Effect o f VH on apotosis o f HepG2 cells by flow cytom etry．HepG2 cells were incubated for 24 h．A：normal controlgroup；B－F：VH 0．1，0．2，0．3，0．4 and 0．5 g·L－1group，respectively．

Tab．2 Effec t o f VH on apo tosis o f HepG2 cells

2．5 藜蘆堿對HepG2細(xì)胞ROS水平的影響

ROS的檢測結(jié)果見圖5，與正常對照組相比，H2O2100μm o l·L－1組ROS顯著升高（P＜0．01）；與H2O2組相比，藜蘆堿0．2～0．5 g·L－1組ROS水平均顯著升高（P＜0．05，P＜0．01）。

2．6 藜蘆堿對HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位的檢測結(jié)果見圖6，與正常對照組相比，陽性藥羥基氰化間氯苯腙100μmol·L－1組線粒體膜電位顯著降低（P＜0．01），與陽性藥相比，藜蘆堿0．1，0．2，0．3，0．4和0．5 g·L－1作用HepG2細(xì)胞24 h后，線粒體膜電位降低，其中藜蘆堿0．3～0．5 g·L－1組降低明顯（P＜0．01），提示藜蘆堿能明顯地降低線粒體膜電位。

Fig．5 Effect o f VH on reactive oxygen species release in HepG2 cells．A：normal control；B：H2O2100μm ol·L－1；C－G：VH 0．1，0．2，0．3，0．4 and 0．5 g·L－1，respectively；H：the result of statisticalanalysis of A－G．，n＝3．**P＜0．01，com pared w ith norm al controlgroup；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared w ith H2O2group．

Fig．6 Effect o f VH on m itochond rialmembrane potential（MMP）o f HepG2 cells observed by flow cytometry．A：normal control；B：carbonylcyanidem-chlorophenylhydrazone（CCCP）10μmol·L－1；C－G：VH 0．1，0．2，0．3，0．4 and 0．5 g·L－1，respectively；H：the resultof statisticalanalysis of A－G．，n＝3．**P＜0．01，compared w ith normal control group；＃＃P＜0．01，com pared w ith CCCP group．

2．7 藜蘆堿對HepG2細(xì)胞p53、Bax、細(xì)胞色素c、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3 m RNA表達(dá)的影響

Fig．7 Effec t o f VH on exp ression o f p53，Bax，cytoch rom e c，caspase 9 and caspase 3 m RNA in HepG2 cells detec ted by real-tim e PCR．The HepG2 cells were cultured w ith VH 0．1，0．2，0．3，0．4 and 0．5 g·L－1or fluorouracil（5-FU）20 m g·L－1for 24 h，respectively．，n＝3．**P＜0．01，com pared with normal controlgroup；＃＃P＜0．01，compared w ith 5-FU group．

如圖7所示，與正常對照組相比，陽性藥5-FU組相關(guān)凋亡基因p53，Bax，細(xì)胞色素c，胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3 mRNA的表達(dá)均升高（P＜0．01），而藜蘆堿組0．2～0．5 g·L－1均使凋亡相關(guān)基因有不同程度升高（P＜0．05，P＜0．01）；與陽性藥相比，給藥組藜蘆堿0．4～0．5 g·L－1對p53的升高有顯著性差異（P＜0．01）；0．3～0．5 g·L－1對Bax的升高影響顯著（P＜0．01）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，藜蘆堿對HepG2細(xì)胞作用24 h后，顯著抑制了細(xì)胞存活，IC50為0．4 g·L－1。LDH是反應(yīng)外源性物質(zhì)對細(xì)胞膜損傷程度的指標(biāo)，本研究結(jié)果表明，藜蘆堿在0．1～0．5 g·L－1時(shí)與HepG2細(xì)胞作用24 h LDH釋放量逐漸升高，表明藜蘆堿對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞膜造成損傷。

ROS包括氧自由基、過氧化氫及下游產(chǎn)物氧化物等，參與細(xì)胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程，正常狀態(tài)下，ROS的產(chǎn)生與代謝在細(xì)胞內(nèi)維持平衡，當(dāng)細(xì)胞受到外源性毒物刺激時(shí)，這種平衡遭到破壞，ROS爆發(fā)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而損傷細(xì)胞DNA，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，藜蘆堿在0．1～0．5 g·L－1時(shí)HepG2細(xì)胞ROS大量釋放，表明藜蘆堿對HepG2細(xì)胞的促凋亡作用有ROS的參與。

線粒體膜電位是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)重要指標(biāo)，其下降預(yù)示細(xì)胞線粒體受到損傷。本研究結(jié)果表明，藜蘆堿在0．1～0．5 g·L－1時(shí)，HepG2細(xì)胞線粒體膜電位持續(xù)下降。用AnnexinⅤ-FITC／PI凋亡探針檢測發(fā)現(xiàn)，藜蘆堿作用HepG2細(xì)胞后凋亡率顯著升高。結(jié)合藜蘆堿能促使HepG2細(xì)胞線粒體功能下降的結(jié)果推測，藜蘆堿可能是作用于HepG2細(xì)胞線粒體，使線粒體功能達(dá)到崩潰邊緣，瞬間產(chǎn)生大量的ROS，從而攻擊DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

凋亡相關(guān)基因檢測顯示，藜蘆堿可使HepG2細(xì)胞p53，Bax，細(xì)胞色素c、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)均有不同程度的增加。HepG2細(xì)胞為具有野生型P53的人肝癌細(xì)胞系，P53在DNA受損后對細(xì)胞的生長抑制和誘導(dǎo)期凋亡中起重要作用。藜蘆堿作用于人肝癌HepG2細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)ROS增加，過多的ROS攻擊DNA，使DNA受損，激活DNA依賴激酶，從而啟動(dòng)P53。P53將促進(jìn)下游凋亡基因Bax高表達(dá)，大量的Bax作用于線粒體膜，使線粒體結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生紊亂，包括線粒體外基質(zhì)內(nèi)流，滲透壓失衡，細(xì)胞器腫脹，線粒體內(nèi)外膜依次裂解，跨膜電位丟失等，最終受損的線粒體開放通透性轉(zhuǎn)換孔PTP，進(jìn)而釋放細(xì)胞色素c和其他促凋亡蛋白，細(xì)胞色素c和凋亡蛋白酶活化因子結(jié)合募集胞質(zhì)中胱天蛋白酶9前體，并自我剪切活化，進(jìn)一步激活胱天蛋白酶3，啟動(dòng)胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［5－8］。除此之外，LDH釋放增加提示細(xì)胞膜受損，有可能會調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上鈣離子通道，或釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞內(nèi)鈣庫中與鈣結(jié)合蛋白松弛結(jié)合的游離鈣，引起胞漿游離鈣增多，并將這種信號傳遞至線粒體，損傷線粒體，也可能是藜蘆堿導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要原因。

大量的Bc l-2蛋白和線粒體腺苷酸三磷酸酶蛋白在依賴P53的細(xì)胞凋亡中受影響，其中BAX是第一個(gè)被鑒定為受P53調(diào)控的Bcl-2蛋白家族成員，P53調(diào)控一些僅有BH3區(qū)域的蛋白，作為BAX上游調(diào)控機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)P53可以解除與Bc l-2的結(jié)合引起的BAX多聚，使Bax中的BH3外露，促使細(xì)胞凋亡［7］。本研究集體研究發(fā)現(xiàn)，p53的下游基因P21mRA的表達(dá)與P53同步（待發(fā)表），有可能是受P53的影響誘導(dǎo)P21的表達(dá)，共同在細(xì)胞周期中發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖而產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，藜蘆堿對HepG2細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，其細(xì)胞毒作用可能與細(xì)胞膜損傷、線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂以及相關(guān)凋亡基因p53、Bax，細(xì)胞色素c、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的表達(dá)增高有關(guān)。

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Cyto toxic effec t o f veratrine hyd roch lo ride on HepG2 cells and its possib le m echanism

OBJECTlVETo study the hepatotoxicity o f veratrine hyd roch loride（VH）and its m echanism on induction of apoptosis in vitro．METHODSHepG2 cells were exposed to VH 0．1－0．6 g·L－1for24 h，cell viability was exam ined by CCK-8 assay，and the morphologic changes in HepG2 cells were quantified．After the treatmentw ith VH 0．1－0．5 g·L－1for 24 h，cellmembrane injury was exam ined by detecting the release rate of lactate dehydrogenase（LDH）．The effect on reactive oxygen species（ROS），m itochondrialmembrane potential and apoptosis was detected by flow cytometry．The mRNA expression of p53，Bax，cytochrom e c，caspase 9，caspase 3 was eva luated by rea l-tim e PCR．RESULTSHepG2 cell viability was significantly reduced fo llow ing exposure to VH 0．1－0．5 g·L－1．The IC50value was 0．4 g·L－1．The 95%confidence lim itwas 0．2558－0．6965 g·L－1．The LDH re lease rate，ROS and apop tosis rate o f HepG2 ce lls were significantly increased a fter exposure to VH 0．1－0．5 g·L－1for 24 h（P＜0．05，P＜0．01），and the m itochond ria lm em brane potentia lm arked ly dec lined（P＜0．05，P＜0．01）．The expression of p53，Bax，cytochrome c，caspase 9 and caspase 3 was increased（P＜0．05，P＜0．01）．CONCLUSlONVH has cytotoxic potential．Damage to cell membrane and m itochondria and initiation of apoptosis-related genes of caspase 9 and caspase 3 mRNA expression may be the mechanism of apoptosis．

veratrine hydrochloride；HepG2 cells；toxic actions

WANG Yu-guang，Tel：（010）66932201，E-mail：wangyg＠bm i．a(chǎn)c．cn；GAO Yue，Tel：（010）66931312，E-mail：gaoyue＠bm i．a(chǎn)c．cn

LIU Cang-long1，2，WANG Yu-guang2，MA Zeng-chun2，LIANG Qian-de2，XIAO Cheng-rong2，TAN Hong-ling2，TANG Xiang-lin2，GAO Yue2

（1．Schoo l o f Pharm acy，GuangxiMedica l University，Nanning 530000，China；2．Departm ent o f Pharm acoloyg and Toxico logy，Institute o f Radiation Medicine，Academ y of M ilitary Medica l Sciences，Beijing 100850，China）

R285，R966

A

1000-3002（2014）03-0391-07

Foundation item：The project supported by National Basic Research Program of China（2011CB505304）

2014-02-08 接受日期：2014-05-26）

（本文編輯：齊春會）

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2011CB505304）

劉蒼龍，男，碩士研究生，主要從事藥理學(xué)研究，Tel：（010）66931233；E-mail：liucanglong356＠163．com。

王宇光，Tel：（010）66932201，E-mail：wangyg＠bm i．a(chǎn)c．cn；高 月，Tel：（010）66931312，E-mail：gaoyue＠bm i．a(chǎn)c．cn