柚皮素止咳化痰平喘作用的研究

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(四川理工學院化學與制藥工程學院,四川自貢 643000)

柚皮素是柚皮苷的苷元,屬于二氫黃酮類化合物。柚皮素作為一類天然黃酮類化合物,主要存在于柑橘和葡萄柚中。Renugad[1]的研究表明柚皮素可以明顯逆轉鎘誘導肝損傷大鼠的血清肝標記酶的活性而降低鎘毒性和保護大鼠肝細胞的正常組織學結構;Jeon[2]實驗證明柚皮素可以降低高脂飲食大鼠的總膽固醇、甘油三酯和動脈硬化指數,并增加高密度脂蛋白濃度而達到降脂的作用;Kanno[3]證明柚皮素對結腸癌Caco - 2具有細胞毒性作用,也可抑制小鼠肉瘤細胞S - 180的生長。而國內柚皮素的研究也被廣泛關注。楊文青[4]的實驗證明柚皮素可以改善阿爾茨海默病模型大鼠的認知能力。史瑩[5]的細胞實驗證明,柚皮素在體外可以抑制與哮喘病理發(fā)生有關的炎癥因子。但柚皮素止咳、化痰、平喘作用的動物實驗報道甚少,本實驗通過建立相關動物模型,研究柚皮素的止咳化痰平喘作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

磷酸組胺 AR,上海源葉生物科技有限公司;柚皮素 上海金穗生物科技有限公司,批號:2013318;氫溴酸右美沙芬片 批號:121006,北京天衡藥物研究所制藥廠；昆明種小鼠 雌雄各半,體質量20±2g,SPF級,100只,購于重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司,許可證號:SCXK(渝)2007 - 0006。

豚鼠 雌雄各半,體質量(250±50)g,80只,購于重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司,動物合格證號:SCXK(渝)2012 - 0006；403C壓縮霧化器 上海魚躍醫(yī)療設備有限公司;756PC紫外可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;H - 1850R臺式高速離心機 沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2實驗方法

1. 2. 1 豚鼠篩選實驗 80只豚鼠,正常飼養(yǎng)3d后開始實驗,參考文獻[6],實驗前一天先做豚鼠篩選實驗,即將豚鼠逐一關進容積為5L小動物密閉實驗箱內,然后用壓縮霧化器通過噴頭將17. 5%枸櫞酸水溶液噴入實驗箱內,噴霧兩分鐘內不咳嗽者或記錄5分鐘內咳嗽次數少于10次者不用,直到篩選出20只適合做止咳實驗的豚鼠,雌雄各半。再從剩余的60只豚鼠中,篩選出30只適合做平喘實驗的豚鼠,雌雄各半,即將豚鼠逐一置于容積為5L小動物密閉實驗箱,利用壓縮霧化器將2mg/mL的磷酸組胺噴入實驗箱內,150s內出現抽搐或跌倒的豚鼠被選用。

1. 2. 2 柚皮素對小鼠止咳實驗 昆明種小鼠50只,雌雄各半,正常飼養(yǎng)3d后開始實驗。小鼠禁食不禁水12h,稱重,依據體質量隨機分為5組,即正常對照組(生理鹽水)、氫溴酸右美沙芬組(15mg/kg)、柚皮素低、中、高劑量組(10、20、40mg/kg);各組小鼠按照0. 1mL/10g每天灌胃給藥,共7d。末次給藥后30min,將每只小鼠放入500mL燒杯中,吸取0. 3mL濃氨水注入50mg棉球后放入燒杯內,到預定時間,立即將小鼠取出,觀察其1min內典型的咳嗽反應(腹肌收縮或縮胸,同時張大嘴,有時可有咳聲)。若1min內出現5次以上典型咳嗽者,算作"有咳嗽",反之,算作“無咳嗽”[6]。

按照序貫法[7]設計實驗并計算出引起半數小鼠咳嗽的氨水刺激時間(EDT50),計算公式(1)為

式(1)

式中:n為動物數,C為r. x值的總和,r為每劑量動物數,x為劑量(即氨水刺激時間)的對數。求得各組EDT50后,再按公式(2)計算相對值R

式(2)

凡R值>130%算有鎮(zhèn)咳作用,R值>150%算有明顯鎮(zhèn)咳作用,R值<130%無鎮(zhèn)咳作用。

1. 2. 3 柚皮素對豚鼠止咳實驗 將篩選合格的20只豚鼠禁食不禁水12h后稱重,隨機分為2組,即柚皮素低、高劑量組(7、28mg/kg),豚鼠灌胃的藥物劑量根據種屬間等效劑量折算法[8]計算確定。每天按照0. 1mL/10g灌胃給藥,連續(xù)3d。在第一次給藥前和末次給藥后30min,將每只豚鼠置于容積為5L的小動物密閉實驗箱中,用壓縮霧化器通過噴頭將17. 5%枸櫞酸水溶液噴入實驗箱內,持續(xù)15s,記錄豚鼠咳嗽潛伏期(以第一次出現響亮咳嗽的時間作為潛伏期)和自噴霧5min內豚鼠出現響亮咳嗽次數,咳嗽潛伏期超過5min者,以5min計[6]。豚鼠咳嗽潛伏期延長率[9]按照公式(3)計算:

式(3)

1. 2. 4 柚皮素影響小鼠排痰實驗 昆明種小鼠50只,正常飼養(yǎng)3d后開始實驗。小鼠禁食不禁水12h,稱重,依據體質量隨機分為5組,即正常對照組(生理鹽水)、氯化銨組(1000mg/kg)、柚皮素低、中、高劑量組(10、20、40mg/kg),各組小鼠按照劑量0. 1mL/10g每天灌胃給藥,共7d。參考文獻[9],末次給藥后0. 5h,各組小鼠按劑量0. 1mL/10g腹腔注射5%的酚紅溶液,注射后30min,將小鼠頸椎脫臼處死,仰位固定于手術板上,剪開頸前皮膚,分離氣管,剝離氣管周圍組織,剪下甲狀軟骨下緣至氣管分叉處之氣管,用1%碳酸氫鈉溶液2mL洗滌氣管,將氣管洗滌液按照酚紅標準曲線的制備方法操作,在546nm波長處測定其吸收光度值A。根據酚紅標準曲線的回歸方程y=0. 2444x - 0. 014,R2=0. 9993,計算小鼠支氣管洗液中酚紅含量,并按照公式(4)計算化痰率。

式(4)

1. 2. 5 柚皮素對豚鼠平喘實驗 將篩選合格的豚鼠30只禁食不禁水12h后稱重,根據體質量隨機分為3組,即正常對照組(生理鹽水),柚皮素低、高劑組(7、28mg/kg),每天各組豚鼠按照0. 1mL/10g灌胃7d。第一次給藥前和末次給藥30min后,將各組豚鼠逐一置于容積為5L小動物密閉實驗箱,利用壓縮霧化器將2mg/mL的磷酸組胺噴入實驗箱內,持續(xù)15s。記錄豚鼠自噴霧開始出現哮喘的潛伏期(以第一次抽搐跌倒的時間作為潛伏期),引喘潛伏期超過5min者,以5min計[6]。豚鼠哮喘潛伏期延長率按照公式(5)計算:

式(5)

2 結果與討論

2.1柚皮素對小鼠止咳實驗

柚皮素對小鼠止咳實驗結果見表1,由表1可見,與正常對照組比較,柚皮素低劑組小鼠EDT50有延長趨勢(R=125. 9%),但無顯著性差異,柚皮素的中劑和高劑組小鼠EDT50都顯著性的延遲長(R=144. 5%,R=229. 1%),氫溴酸右美沙芬組小鼠EDT50也顯著性的延遲長(R=234. 3%)。

2.2柚皮素對豚鼠止咳作用

柚皮素對豚鼠止咳實驗結果見表2,由表2可見,與給藥前比較,柚皮素低劑組可以顯著性地減少自噴霧5min內枸櫞酸引起豚鼠咳嗽次數(p<0. 01),對豚鼠咳嗽潛伏期的延長有增加趨勢,但沒有顯著性差異,延長率為81. 2%;柚皮素高劑組組雖升可以顯著性地延長豚鼠咳嗽潛伏期(p<0. 01),延長率為165. 3%,并減少自噴霧5min內枸櫞酸引起豚鼠咳嗽次數(p<0. 01)。

表2 柚皮素對豚鼠止咳作用Table 2 The cough relieving effect of Naringenin on guinea pigs

注:#與給藥前比較,##p<0. 01。

表1 柚皮素對小鼠止咳作用Table 1 The cough relieving effect of Naringenin on mice

咳嗽是由于呼吸道內分泌物或異物等刺激呼吸道粘膜,通過神經反射產生咳嗽動作,將呼吸道內分泌物排出[10]。

表4 柚皮素對豚鼠的平喘作用Table 4 The antiasthma effect of Naringenin on guinea pigs

注:*與正常對照組比較,* *p<0. 01;#與給藥前比較,##p<0. 01。

本研究建立兩種引咳動物模型,濃氨水對小鼠引咳模型和枸櫞酸引咳豚鼠動物模型。這兩種動物模型分別利用濃氨水和17. 5%枸櫞酸刺激動物呼吸道粘膜而引發(fā)咳嗽,其機制是濃氨水和枸櫞酸刺激動物氣道粘膜時,興奮了支氣管壁上分布的對化學刺激敏感的無髓鞘C傳入神經纖維,同時增加氣道分泌物。柚皮素中、高劑量組對濃氨水引咳小鼠均有止咳效果,柚皮素高劑組還可以顯著性地延長枸櫞酸誘導豚鼠咳嗽潛伏期(p<0. 01),并減少咳嗽次數(p<0. 01),提示柚皮素可能阻礙了咳嗽反射弧中神經沖動的正常傳導,而對濃氨水引咳的小鼠和枸櫞酸引咳的豚鼠產生了良好的止咳作用。

2.3柚皮素影響小鼠排痰實驗

柚皮素促進小鼠排痰實驗結果見表3,由表3可見,與正常對照組比較,氯化銨組小鼠氣管酚紅含量顯著性增加(p<0. 05),化痰率為151. 4%,柚皮素高劑組小鼠氣管酚紅含量也顯著性增加(p<0. 05),化痰率為150. 9%。

咳嗽的診斷與治療指南(2009版)[11]指出,急性支氣管炎常伴有痰,痰是機體受到外界化學、機械或生物等刺激時,氣道和支氣管的腺體和杯狀細胞分泌的產物,具有一定的保護作用,但粘稠的痰和因感染引起的膿痰會成為異物而刺激氣道感受器而引起咳嗽。柚皮素高劑組與氯化銨組可以顯著性地增加小鼠支氣管酚紅排出量(p<0. 05),且化痰率與氯化銨陽性對照組無顯著性差異,說明柚皮素可以通過增加痰液排出而減輕小鼠咳嗽癥狀。

表3 柚皮素對小鼠排痰的影響 Table 3 The expectoration effect of Naringenin on mice

注:*與正常對照組比較,*p<0. 05。

2.4柚皮素對豚鼠平喘作用實驗

柚皮素對豚鼠平喘作用實驗結果見表4,由表4可見,與正常對照組比較,柚皮素高劑組可以顯著性地延長豚鼠由于磷酸組胺誘導哮喘出現的潛伏期(p<0. 01);與給藥前比較,柚皮素高劑組可以顯著性地延長豚鼠哮喘潛伏期(p<0. 01),延長率為242. 2%,正常對照組、柚皮素低劑組豚鼠呈現哮喘潛伏期延長的趨勢,但沒有統(tǒng)計學意義,可能與豚鼠體重增加,對再次磷酸組胺刺激敏感性降低有關。

本實驗用2mg/mL的磷酸組胺誘發(fā)豚鼠哮喘,其機制王山澤[12]證明磷酸組胺可以興奮支氣管平滑肌上的H1 - R,H1 - R可引起氣道和消化道平滑肌收縮,皮膚風疹塊,增加呼吸道粘液分泌,使毛細血管內皮細胞粘合變疏松而致水腫,并可引起低血壓和心律失常,故豚鼠出現呼吸困難、抽搐跌倒等哮喘的癥狀。而哮喘是由于免疫學異常所致的慢性炎癥疾病,其發(fā)生與嗜酸性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞等多種炎癥、非炎癥細胞及炎性介質關系密切。Makinde T[13]的研究表明,在哮喘病理生理過程中,轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF - β1)在炎癥的發(fā)生和氣道重塑中起重要作用,TGF - β1可以延長一些免疫炎性細胞的存活期而參與氣道炎性反應,還可以通過調節(jié)相關蛋白基因的表達而導致纖維沉積引起氣道重塑[14 - 15]。史瑩[5]的體外細胞實驗表明,柚皮素是通過抑制Smad2 磷酸化而使TGF - β1的信號無法正常轉導,從而影響了TGF - β1的生物功能。實驗設計用磷酸組胺誘發(fā)豚鼠哮喘發(fā)生,豚鼠經過柚皮素7d的治療干預,可以顯著地延長磷酸組胺誘發(fā)哮喘的潛伏期,可能與柚皮素在體內也抑制TGF - β1的產生有關,從而減少了呼吸道炎性細胞的產生,減輕豚鼠哮喘癥狀,但還需進一步實驗證明。

3 結論

3.1柚皮素可以延長引起半數小鼠咳嗽的氨水噴霧時間(EDT50),且呈劑量依賴性;柚皮素低劑組(7mg/kg)可以顯著性地減少枸櫞酸引起豚鼠咳嗽次數,但對豚鼠咳嗽潛伏期的延長僅有增加趨勢,柚皮素高劑組(28mg/kg)可以顯著性地延長枸櫞酸誘導豚鼠咳嗽的潛伏期,并減少咳嗽的次數,與氫溴酸右美沙芬的作用相似;提示柚皮素可能阻礙了小鼠和豚鼠咳嗽反射弧中神經沖動的正常傳導而產生止咳作用。

3.2柚皮素高劑組(28mg/kg)可以增加小鼠氣管酚紅排出量,作用與氯化銨相似,提示柚皮素可以通過促進小鼠痰液的排出而減輕咳嗽癥狀。

3.3柚皮素高劑組(28mg/kg)可以顯著性地延長磷酸組胺誘導豚鼠哮喘發(fā)生的潛伏期,從而減輕豚鼠哮喘癥狀,其機制可能是柚皮素在體內抑制了TGF - β1的產生而減少呼吸道炎性細胞的產生,但還需進一步實驗證明。

綜上結果提示,柚皮素具有良好的止咳化痰平喘作用,為柚皮素的開發(fā)利用提供實驗依據。

[1]Renugad evi J,Prabu SM. Cadmium - induced hepatotoxicity in rats and the protective effect of naringenin[J]. Exp Toxicol Pathol,2010,62:171 - 181.

[2]Jeon Sm,Kim Hk,Kim Hj,etal. Hypocholesterolemic and antioxidative effects of naringenin and its two metabolites in high- cholesterol fed rats[J]. Translational Research,2007,149(1):15 - 21.

[3]Kanno S,Tomizawa A,Hiura T,etal. Inhibitory effects of naringenin on tumor growth in human cancer cell lines and sarcoma S - 180 - implanted mice[J]. Biol Pharm Bull,2005,28(3):527 - 530.

[4]楊文青,馬晶,余華榮. 柚皮素改善阿爾茨海默病模型大鼠的認知能力及其機制研究[J]. 中草藥,2013,44(6):715 - 720.

[5]史瑩,谷偉,孫麗華,等. 柚皮素對支氣管上皮細胞中Smad介導的TGF - β1通路的影響[J]. 南京醫(yī)科大學學報：自然科學版,2013,33(2):155 - 159.

[6]陳奇. 中藥藥理研究方法學(第三版)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:613 - 622.

[7]劉賓,江南. 序貫法研究甘草酸二銨對小鼠鎮(zhèn)咳作用[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2009,29(10):820 - 822.

[8]魏偉,吳希美,李元建. 藥理實驗方法學(第4版)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:1698.

[9]包桂蘭,杜智敏,趙中華,等. 五味沙棘散止咳祛痰平喘作用的實驗研究[J]. 現代中西醫(yī)結合雜志,2009,18(3):243 - 247.

[10]邱忠民. 慢性咳嗽診斷和治療的進展[N]. 同濟大學學報：醫(yī)學版,2005,26(1):9 - 14.

[11]中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組. 咳嗽的診斷與治療指南[J]. 全科醫(yī)學臨床與教育,2009,7(5):453 - 456.

[12]王山澤,鄧琨. 組織胺受體與支氣管哮喘[J]. 國外醫(yī)學呼吸系統(tǒng)冊,1990,10(3):113 - 116.

[13]Makinde T,Murphy RF,Agrawal DK. The regulatory role of TGF - beta in airway remodeling in asthma[J]. Immunol Cell Biol,2007,85(5):348 - 356.

[14]Black PN,Young PG,Skinner SJ. Response of airway smooth muscle cells to TGF - beta l:effects on growth and synthesis of glycosaminoglycans[J]. Am J Physiol,1996,271:910 - 917.

[15]Samarakoon R,Higgins PJ. Integration of non - SMAD and SMAD signaling in TGF - beta1 - induced plasminogen activator inhibitor type - 1 gene expression in vascular smooth muscle cells[J]. Thromb Haemost,2008,100(6):976 - 983.