分子印跡基質(zhì)固相分散快速分離分析辣椒制品中的蘇丹紅

, ,,,立鋼

(東北林業(yè)大學(xué)理學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

蘇丹紅是一種非天然的化學(xué)染色劑,是人工合成的含有萘環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物,同時(shí)含有偶氮結(jié)構(gòu)。由于其色彩鮮澤,常用于工業(yè)染料方面。蘇丹紅被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸類為三類致癌物質(zhì)即動(dòng)物致癌物,對(duì)人類也有潛在的危害。而且毒理學(xué)相關(guān)研究表明,蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ有致突變性和致癌性,美國(guó)歐盟等都已明文規(guī)定禁止將蘇丹紅添加到食品中,近年來(lái)我國(guó)也禁止將它使用在相關(guān)食品添加劑中[1 - 3]。目前常用HPLC、GC/MS、LC/MS、GPC/LC、極譜法、ELISA等方法對(duì)食品中的蘇丹紅進(jìn)行檢測(cè)。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法,檢測(cè)靈敏度差,耗時(shí)長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)是采用分子印跡技術(shù)(MIT)和基質(zhì)固相分散萃取(MSPD)聯(lián)用的一種新型檢測(cè)蘇丹紅的方法。分子印跡技術(shù)目前是比較成熟的一門(mén)科學(xué)技術(shù),始于生物化學(xué),材料科學(xué)等學(xué)科,在色譜分離,固相萃取,食品檢驗(yàn)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等都有十分廣泛的應(yīng)用[4 - 6]。制備得到的分子印跡聚合物(MIP)擁有預(yù)定性,特異識(shí)別性和廣泛使用性三個(gè)特點(diǎn)。在已有的報(bào)道中,蘇丹紅 - 分子印跡聚合物已經(jīng)被成功制備出來(lái),并且作為固相萃取的吸附劑萃取分離辣椒等樣品中的蘇丹紅[7 - 9]。然而,在制備過(guò)程中,大多采用的是本體聚合技術(shù),得到的聚合物,模板分子包埋過(guò)深,不利于洗脫和再結(jié)合。并且,在應(yīng)用之前,需采用一定的溶劑將蘇丹紅從固體樣品中提取出來(lái),然后再進(jìn)一步進(jìn)行固相萃取凈化處理,步驟繁瑣。本實(shí)驗(yàn)采用表面印跡技術(shù),以納米SiO2為載體,蘇丹紅IV為模版分子,甲基丙烯酸為功能單體,二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑制備分子印跡聚合物。表面印跡技術(shù)可以很好的解決傳統(tǒng)的本體聚合帶來(lái)的模板分子包埋過(guò)深等問(wèn)題。所得分子印跡物作為基質(zhì)固相萃取中的吸附劑萃取辣椒制品中的蘇丹紅?；|(zhì)固相分散技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便,集萃取、凈化、濃縮于一體,而且樣品和提取溶劑用量少,環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)[10]。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

二甲基丙烯酸乙二醇酯 美國(guó)Sigma - Aldrich;蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品、硅烷偶聯(lián)劑KH570 上海阿拉丁;偶氮二異丁腈、甲醇、乙醇甲基丙烯酸、乙酸、98%濃硫酸 天津科密歐;乙腈 色譜純,美國(guó)Fisher;納米SiO2宣城晶瑞;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。實(shí)驗(yàn)中所用到的辣椒面和辣椒醬樣品均購(gòu)買(mǎi)于哈爾濱當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

H7650電子顯微鏡 日本日立公司;LC - 15C液相色譜 日本島津公司;HSY - B 恒溫振蕩搖床 金壇市精達(dá)儀器制造廠;FT - IR360傅立葉紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司;DZKW - C恒溫水浴鍋 上海樹(shù)立公司。

1. 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

在100mL甲醇中分別溶解5. 0mg蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ配制得到50μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,保存在冰箱中。

1. 3 分子印跡聚合物的制備

將KH570在純甲苯(25mL),蒸餾水(8mL)和98%濃硫酸(6. 5mL)中65℃水解4h,分液漏斗去水層,再加入納米SiO2(1. 0g),98%濃硫酸(2mL)在油浴中114℃條件下反應(yīng)4h。純甲醇洗滌離心干燥10h制得SiO2- KH570。取模板分子蘇丹紅Ⅳ(1mmol)加入功能單體甲基丙烯酸(4mmol)和氯仿(20mL)的混合液中攪拌1h。再加入交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(20mmol)和引發(fā)劑偶氮二異丁腈(0. 06g),SiO2- KH570(1. 0g)在磁力攪拌300r/min水浴60℃下反應(yīng)24h。合成后的產(chǎn)物用純甲醇洗滌離心多次后,置于60℃烘箱中干燥。以20%乙酸甲醇為溶劑對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行索氏提取至無(wú)色,最后真空干燥,即得到分子印跡聚合物MIP。而非分子印跡聚合物NIP與MIP制備方法一樣,只是不加入模板分子蘇丹紅Ⅳ。

1. 4 MIP和NIP吸附等溫線的測(cè)定

分別在2. 0mL不同濃度的蘇丹紅IV溶液中加入MIP和NIP 20. 0mg,恒溫震蕩24h,離心后用HPLC檢測(cè)蘇丹紅IV的剩余濃度。

1. 5 MIP和NIP的動(dòng)力學(xué)考察

稱取MIP和NIP各20. 0mg與2. 0mL蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)溶液振蕩1、3、4、5、7、9min,離心后用HPLC檢測(cè)蘇丹紅Ⅳ的剩余濃度。

1. 6 基質(zhì)固相分散萃取分離辣椒制品中蘇丹紅

稱取辣椒面0. 05g,分子印跡聚合物0. 05g,在研缽中混合研磨8min。轉(zhuǎn)移到空的注射器中,用4mL 5%的乙酸乙醇進(jìn)行洗脫,用HPLC檢測(cè)洗脫液中蘇丹紅的含量。

實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化了影響萃取蘇丹紅的各種因素,采用的是單因變量法,即在固定其它條件下,改變某一條件,研究其對(duì)萃取效果的影響。以四種蘇丹紅的回收率為考量指標(biāo),能夠得到最佳蘇丹紅回收率的條件即為最優(yōu)條件?？疾斓妮腿l件包括MIP與辣椒面比例(1/2,1/1,3/2,2/1,5/2,3/1),研磨時(shí)間(2、4、6、8、10min),洗脫劑種類(純甲醇、1%乙酸甲醇、5%乙酸甲醇、純乙醇、1%乙酸乙醇、5%乙酸乙醇)和洗脫體積(1、2、3、4、5、6、7mL)。

1. 7 液相色譜分析

安捷倫SB - C18色譜柱(150mm × 4. 6mm,5μm);進(jìn)樣量20μL;流動(dòng)相為純乙腈;流速1. 0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)505nm。

2 結(jié)果與分析

2. 1 分析印跡聚合物的表征

分子印跡聚合物的電鏡圖如圖1所示,徑粒分布大小均勻,大約為40 ～ 50nm。分子印跡聚合物和二氧化硅的紅外光譜圖如圖2所示。對(duì)于分子印跡聚合物,3435cm-1處為O - H的伸縮振動(dòng)吸收峰;2956cm-1處為C - H的伸縮振動(dòng)吸收峰;1731cm-1處為C=O伸縮振動(dòng)吸收峰;1456cm-1和1386cm-1處為C - H彎曲振動(dòng)吸收峰;1155cm-1處為Si - O振動(dòng)吸收峰。對(duì)于二氧化硅,3418cm-1處為O - H的伸縮振動(dòng)吸收峰;1132cm-1處為Si - O振動(dòng)吸收峰。

圖1 分子印跡聚合物的透射電鏡圖Fig. 1 The TEM image of MIP

圖2 分子印跡聚合物的紅外譜圖Fig. 2 FTIR spectra of MIP

2. 2 吸附等溫的測(cè)定和Scatchard分析

吸附到聚合物上蘇丹紅Ⅳ的量為Q(mg/g)。計(jì)算公式為:Q=(Ci-Cf)V/m;Ci(mg/L)為蘇丹紅Ⅳ的初始濃度;Cf(mg/L)為蘇丹紅Ⅳ的平衡濃度;V(mL)為吸附溶液的體積;m為聚合物的質(zhì)量(mg)。

聚合物對(duì)蘇丹紅IV的平衡吸附量隨著蘇丹紅IV濃度的增加而增加(圖3)。進(jìn)一步將該結(jié)果進(jìn)行Scatchard分析,擬合方程為Q/Cf=(Qmax-Q)/Kd。式中,Q(mg/g)為聚合物對(duì)蘇丹紅Ⅳ的吸附量;Cf(mg/L)為蘇丹紅Ⅳ的平衡濃度;Qmax(mg/g)為最大表觀結(jié)合量;Kd(mg/L)為結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)。以Q/Cf對(duì)Q作圖(圖4)。在測(cè)定的濃度范圍內(nèi),對(duì)于MIP而言,可以擬合出兩條線性關(guān)系(圖4a),即MIP對(duì)模板分子存在兩種結(jié)合位點(diǎn)。MIP這兩種結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合量和平衡離解常數(shù)分別為Qmax1=0. 8306mg/g,Kd1=4. 760mg/L;Qmax2=4. 146mg/g,Kd2=112. 4mg/L。對(duì)NIP進(jìn)行擬合只能得到一條線性關(guān)系(圖4b),即NIP對(duì)模板分子只有一種結(jié)合方式,經(jīng)計(jì)算得到的最大表觀結(jié)合量和平衡離解常數(shù)分別為Qmax=0. 8692mg/g;Kd=29. 07mg/L。

圖3 MIP及NIP對(duì)蘇丹紅IV的吸附等溫線Fig. 3 Binding isotherms of MIP and NIP

圖4 MIP(a)和NIP(b)Scatchard分析曲線Fig. 4 Scatchard plot analysis of MIP(a)and NIP(b)

2. 3 吸附動(dòng)力學(xué)考察

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到聚合物對(duì)蘇丹紅在不同時(shí)間內(nèi)的吸收量Qt(mg/g),結(jié)果如圖5所示。

圖5 MIP和NIP吸附動(dòng)力學(xué)結(jié)果Fig. 5 The kinetic curves of MIP and NIP

分別對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合,擬合方程分別為:ln(Qe-Qt)=lnQe-k1t和t/Qt=1/k2Qe2+t/Qe。式中,Qt(mg/g)是不同時(shí)間的吸收量,Qe(mg/g)是平衡時(shí)的吸附量,k1(min-1)和k2(g·mg-1·min-1)分別是準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)的吸收速率常數(shù)。

對(duì)MIP和NIP分別由ln(Qe-Qt)對(duì)t作圖(圖6a)進(jìn)行準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合得到直線y= - 0. 0099x+3. 677,R2=0. 632和y= - 0. 0158x+3. 4306,R2=0. 8037。對(duì)MIP和NIP分別由t/Qt對(duì)t作圖(圖6b)進(jìn)行準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合得到直線y=0. 1451x+0. 0542,R2=0. 9995和y=0. 0856x+0. 0266,R2=0. 999。由結(jié)果可知MIP和NIP對(duì)蘇丹紅的吸收均符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附模型。

2. 4 萃取條件的優(yōu)化

應(yīng)用制備得到的MIP作為基質(zhì)固相分散的吸附劑對(duì)辣椒面中的4種蘇丹紅進(jìn)行萃取,優(yōu)化了影響萃取結(jié)果的條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)MIP與辣椒制品比例為1∶ 1,研磨時(shí)間為8min,采用4mL 5%乙酸乙醇作為洗脫劑得到的蘇丹紅萃取效果最佳。

2. 5 分析方法評(píng)價(jià)及應(yīng)用

采用液相色譜檢測(cè)4種蘇丹紅,色譜圖如圖7所示。線性范圍為0. 05 ～ 10μg/mL。蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的檢出限分別為0. 016,0. 015,0. 011和0. 010μg/mL。精密度的考察是通過(guò)對(duì)同一批辣椒樣品連續(xù)分析6次,得到測(cè)定蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為4. 8%,3. 2%,5. 4%和5. 0%。本實(shí)驗(yàn)又對(duì)樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),得到的蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的加標(biāo)回收率分別為96. 4%,95. 7%,94. 4%和98. 3%。從哈爾濱市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)了5種辣椒面和5種辣椒醬,應(yīng)用此方法進(jìn)行檢測(cè),均未發(fā)現(xiàn)蘇丹紅的存在。隨后我們對(duì)這些樣品進(jìn)行了蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),得到的四種蘇丹紅的回收率在94. 7% ～ 98. 4%范圍內(nèi),證明了本方法可以很好的應(yīng)用于不同辣椒樣品基質(zhì)的分析中。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以蘇丹紅Ⅳ為模板分子,以表面印跡法制備得到了分子印跡聚合物。對(duì)其進(jìn)行了吸附等溫線的測(cè)定,Scatchard分析以及動(dòng)力學(xué)分析。最后將其應(yīng)用于基質(zhì)固相分散的吸附劑萃取分離辣椒制品的4種蘇丹紅。由于蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的結(jié)構(gòu)式類似,因此4種蘇丹紅均能被所合成的MIP提取出來(lái),且得到了較高的回收率。該方法減少了樣品預(yù)處理的步驟,快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。

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