玉米芯廢液中純化L阿拉伯糖的研究

， ， ，

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建福州 350108)

玉米芯廢液是提取過木糖之后的副產(chǎn)品,是較為豐富而廉價(jià)的可利用資源,所以采用玉米芯廢液的成本遠(yuǎn)小于玉米芯原料。玉米皮經(jīng)稀硫酸水解后得到了以L- 阿拉伯糖、木糖和葡萄糖為主要成分的水解液[1]。L- 阿拉伯糖屬于五碳醛糖,以L- 阿拉伯聚糖、L- 阿拉伯糖基本聚糖、L- 阿拉伯糖基半乳糖體及類似于高等植物半纖維的形式存在[2]。L- 阿拉伯糖是一種新型的無熱量功能性糖,對(duì)傳統(tǒng)糖類的吸收有競(jìng)爭(zhēng)性阻斷作用[3]。L- 阿拉伯糖是一種重要的醫(yī)藥中間體,可用來合成抗癌、抗病毒和治療心血管疾病的藥物[4 - 5]。其最顯著的作用是抑制人體小腸內(nèi)蔗糖酶的活性,降低蔗糖的分解,從而調(diào)節(jié)人體對(duì)蔗糖的過量吸收并抑制新脂肪的形成。其在減肥,控制糖尿病等方面的應(yīng)用前景很好[6 - 7]。然而自然界中阿拉伯糖含量較低,尤以玉米芯、甜菜根等植物中含量較高[1]。但是L- 阿拉伯糖的純度達(dá)到一定的級(jí)別方可作為食品食用,所以研究L- 阿拉伯糖的提取及分離純化有重要意義。常見的提取方法包括水酸提取法、堿提取法[8 - 9]、酶提取法[10]、微生物發(fā)酵法[11]、化學(xué)合成法[12]及高壓蒸汽法[13]等。現(xiàn)對(duì)提取過木糖醇的玉米芯廢液用酸解法得到含L- 阿拉伯糖混合液,再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、活性炭脫色、無水乙醇去無機(jī)鹽離子并采用響應(yīng)面分析法得到較純的L- 阿拉伯糖晶體的最佳條件[14]。該方法簡(jiǎn)便、效率高。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

提取木糖醇后的玉米芯廢液 河南某生物公司;L- 阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

4. 00%、5. 00%、6. 00%的濃硫酸、活性炭、氫氧化鈉、鹽酸、冰醋酸、三氯化鐵 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;3,5 - 二羥基甲苯 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

電子天平 精確度0. 0001g,上海精密儀器公司;手掌式離心機(jī) 海門其林貝爾制造公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱 福建裕華化玻有限公司;紫外分光光度計(jì)、THZ - C恒溫振蕩器 江蘇省太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;HJ - 6多頭加熱磁力旋轉(zhuǎn)器 常州國(guó)華電器有限公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 顯色劑的制備 參考文獻(xiàn)[15],A:稱取3,5 - 二羥基甲苯適量,用鹽酸 - 冰醋酸(1∶ 3)的混合液溶解,配成濃度為0. 1 %的3,5 - 二羥基甲苯溶液;B:配1mol·L-1的三氯化鐵溶液。臨用前,取A溶液99mL與B溶液1mL混合,搖勻,即得3,5 - 二羥基甲苯三氯化鐵顯色劑。

1. 2. 2 酸解法提取L- 阿拉伯糖

1. 2. 2. 1L- 阿拉伯糖的提取 取提取過木糖醇的玉米芯廢液30mL,加入5. 00%硫酸300mL,95. 00℃水浴2. 00h[16]。抽濾,取其濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至30mL轉(zhuǎn)移至燒杯中。在80. 00℃水浴中預(yù)熱5min,將燒杯取出,加入液體體積1%的活性炭,攪拌脫色約10 ～ 15min。往脫色后的濃縮液中加入其4倍體積的無水乙醇進(jìn)行低溫結(jié)晶,靜置過夜。次日,將上述的無水乙醇用吸管吸干,再將其在56℃的烘箱內(nèi)烘干。向烘干后的固體里加入100mL的無水乙醇除去其中的無機(jī)鹽離子。最后除去無水乙醇即得到粗的L- 阿拉伯糖。

1. 2. 2. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取2、4、6、8mL的L- 阿拉伯糖對(duì)照品(54. 120μg·mL-1)置于容量瓶中,補(bǔ)加蒸餾水稀釋到10mL,配成濃度分別為10. 824、21. 648、32. 472、43. 296μg·mL-1的對(duì)照品溶液。吸取上述對(duì)照品溶液1mL,加入3,5 - 2二羥基甲苯三氯化鐵顯色劑4mL,充分混勻,置沸水浴中加熱30min后迅速放入冰水中冷卻到室溫,在665nm處測(cè)定吸收度。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),吸收度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。

1. 2. 2. 3 實(shí)驗(yàn)樣品中L- 阿拉伯糖含量的測(cè)定 取0. 005g粗提的阿拉伯糖樣品,配制成500μg·mL-1的母液,再稀釋成所需的濃度(100、200、400μg·mL-1)。精密吸取上述對(duì)照品溶液1mL,加入3,5 - 2二羥基甲苯三氯化鐵顯色劑4mL,充分混勻,置沸水浴中加熱30min 后迅速放入冰水中冷卻到室溫,在665nm處測(cè)定吸收度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中L- 阿拉伯糖的含量。

1. 2. 3 酸解法分離純化L- 阿拉伯糖條件的優(yōu)化

1. 2. 3. 1 硫酸水解玉米芯工業(yè)廢液中L- 阿拉伯糖的單因素預(yù)實(shí)驗(yàn) 通過單因素預(yù)實(shí)驗(yàn),確定硫酸濃度、硫酸用量、水解時(shí)間、水解溫度并進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1. 2. 3. 2 硫酸濃度對(duì)L- 阿拉伯糖含量的影響 準(zhǔn)確量取5份玉米芯工業(yè)廢液5mL,硫酸∶ 玉米芯廢液為10. 00∶ 1,溫度為90. 00℃,水解時(shí)間為2. 50h,考察不同硫酸濃度對(duì)玉米皮中L- 阿拉伯糖含量的影響。

1. 2. 3. 3 硫酸∶ 玉米芯廢液對(duì)L- 阿拉伯糖含量的影響 準(zhǔn)確量取5份玉米芯工業(yè)廢液5mL,硫酸濃度為5. 00%,溫度為90. 00℃,水解時(shí)間為2. 50h,計(jì)算不同硫酸∶ 玉米芯廢液對(duì)玉米皮中L- 阿拉伯糖水解含量的影響。

1. 2. 3. 4 水解溫度對(duì)L- 阿拉伯糖含量的影響 準(zhǔn)確量取5份玉米芯工業(yè)廢液5mL,硫酸濃度為5. 00%,硫酸∶ 玉米芯廢液為10∶ 1,水解時(shí)間2. 50h,考察不同水解溫度對(duì)玉米皮中L- 阿拉伯糖水解含量的影響情況。

1. 2. 3. 5 水解時(shí)間對(duì)L- 阿拉伯糖含量的影響 準(zhǔn)確量取5份玉米芯工業(yè)廢液5mL,硫酸濃度為5. 00%,溫度為90. 00℃,硫酸∶ 玉米芯廢液為10. 00∶ 1,不同水解時(shí)間為1. 00、1. 50、2. 00、2. 50、3. 00h對(duì)玉米皮中L- 阿拉伯糖水解含量的影響。

1. 2. 4 應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化L- 阿拉伯糖的分離純化條件 應(yīng)用Design - Expert. 8. 05b響應(yīng)面分析軟件提供的模型,設(shè)硫酸濃度(A)、硫酸∶ 玉米芯廢液(B)、水解溫度(C)、水解時(shí)間(D)4個(gè)因素為自變量,L- 阿拉伯糖水解得率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平的實(shí)驗(yàn),并根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定三因素的零水平和波動(dòng)區(qū)。實(shí)驗(yàn)因素與水平的取值表見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface test

2 結(jié)果與分析

2. 1 實(shí)驗(yàn)樣品中L - 阿拉伯糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。回歸方程為y=0. 0242x+0. 0035,R2為0. 9984,在10. 824 ～ 54. 120μg·mL-1范圍內(nèi)呈線形關(guān)系。

圖1 L - 阿拉伯糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of L - arabinose content

2. 2 硫酸濃度對(duì)L - 阿拉伯糖含量的影響

圖2為不同硫酸濃度對(duì)玉米皮中L- 阿拉伯糖含量的影響。當(dāng)硫酸濃度為5. 00%時(shí),L- 阿拉伯糖水解后含量達(dá)到最大值12. 97μg·mL-1,再增大硫酸濃度,L- 阿拉伯糖的含量不再增加反而下降。這可能是因?yàn)樵诟邷叵略龃笏岬臐舛燃觿×似渌狈磻?yīng)的發(fā)生,比如玉米芯廢液中殘留的部分木糖脫水生成了糠醛[5]。隨硫酸濃度的提高,水解液的顏色變深,這給活性炭脫色處理帶來難度。

圖2 硫酸濃度對(duì)L - 阿拉伯糖純化的影響Fig. 2 Effect of sulfuric acid concentration on the L - arabinose purification

2. 3 硫酸用量對(duì)玉米芯廢液中L - 阿拉伯糖含量的影響

不同的硫酸用量對(duì)玉米皮中L- 阿拉伯糖水解后含量的影響如圖3所示。當(dāng)硫酸用量為玉米芯工業(yè)廢液體積的6倍時(shí)水解程度達(dá)到最高,繼續(xù)增大硫酸用量L- 阿拉伯糖的含量反而下降。如圖3所示,硫酸∶ 玉米芯廢液為4. 00∶ 1時(shí),原料可能未能被充分被浸泡,很大一部分玉米芯廢液未能參與酸解反應(yīng),因而L- 阿拉伯糖含量較低。硫酸∶ 玉米芯廢液增大至6. 00∶ 1,含量迅速上升,達(dá)到最大值。硫酸:玉米芯廢液繼續(xù)增加,L- 阿拉伯糖含量反而減小。

圖3 硫酸∶ 玉米芯廢液對(duì)L - 阿拉伯糖純化的影響Fig. 3 Effect of sulfuric acid:corncob waste on the L - arabinose purification

2. 4 水解溫度對(duì)L - 阿拉伯糖含量的影響

不同水解溫度對(duì)玉米皮中L- 阿拉伯糖水解后含量的影響情況如圖4所示:溫度升高有利于加速玉米芯廢液酸解生成單糖,L- 阿拉伯糖含量也隨之增高,當(dāng)溫度達(dá)到95. 00℃時(shí),L- 阿拉伯糖含量基本達(dá)到最大值;在100. 00℃時(shí)L- 阿拉伯糖含量有下降的趨勢(shì),這可能是在高溫和酸催化下,部分玉米芯廢液酸解產(chǎn)生其他副產(chǎn)物(木糖脫水生成了糠醛)。因此,選取反應(yīng)溫度95. 00℃為最佳水解溫度。

圖4 水解溫度對(duì)L - 阿拉伯糖純化的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis temperature on the L - arabinose purification

2. 5 水解時(shí)間對(duì)L - 阿拉伯糖含量的影響

不同水解時(shí)間為1. 00、1. 50、2. 00、2. 50、3. 00h時(shí)對(duì)玉米芯廢液中L- 阿拉伯糖水解后含量的影響如圖5所示。L- 阿拉伯糖含量隨著水解時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),3. 00h時(shí)L- 阿拉伯糖含量達(dá)到最大值。隨著時(shí)間的增加,會(huì)使酸解液顏色更深,對(duì)于下面的脫色更難,所以選擇3. 00h作為最佳酸解時(shí)間。水解時(shí)間為2. 50h和3. 00h時(shí),測(cè)量誤差較大,可能原因是水解時(shí)間的增加,使得酸解更徹底,使得玉米芯廢液中殘留的部分木糖脫水生成了糠醛[5],在測(cè)定L- 阿拉伯糖含量時(shí)造成較大的誤差。

圖5 水解時(shí)間對(duì)阿拉伯糖純化的影響Fig. 5 Effect of hydrolysis time on the L - arabinose purification

2. 6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2. 6. 1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Box - Benhnken四因素三水平實(shí)驗(yàn)所得L- 阿拉伯糖含量見表2,模型共設(shè)29個(gè)實(shí)驗(yàn),其中16、18、20、21、24號(hào)實(shí)驗(yàn)為中心實(shí)驗(yàn),其余的為析因?qū)嶒?yàn)。析因?qū)嶒?yàn)構(gòu)成三維定點(diǎn),中心實(shí)驗(yàn)為區(qū)域的中心,重復(fù)五次中心實(shí)驗(yàn)以估計(jì)誤差。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The response surface experimental design and results

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 The results of regression analysis

注:*差異性顯著(p<0. 05),* *差異性極顯著(p<0. 01)。

2. 6. 2 模型建立 利用Design - Expert8. 0. 5b軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元擬合,得到硫酸濃度(A)、硫酸:玉米芯廢液(B)、水解溫度(C)、水解時(shí)間(D)二次多項(xiàng)回歸方程:L- 阿拉伯糖含量=14. 22 - 0. 12A - 0. 43B+0. 063C+0. 29D - 0. 65AB+0. 043AC - 0. 050AD -0. 89BC+0. 99BD - 0. 62CD+1. 32A2+1. 17B2- 0. 39C2+1. 63D2

2. 6. 4 響應(yīng)面分析 為了更直觀地反映四個(gè)因素之間的相互作用對(duì)提取含量的影響,做出兩兩自變量為坐標(biāo)的3D圖。由圖6可知,L- 阿拉伯糖提取量曲線呈現(xiàn)出先上升到平緩穩(wěn)定再到略有下降的狀態(tài)。 隨著硫酸濃度(A)的升高與硫酸∶ 玉米芯廢液(B)增加,提取量上升。當(dāng)硫酸濃度、硫酸∶ 玉米芯廢液分別增大到一定程度時(shí),提取量(Y)趨于飽和,響應(yīng)曲面變平緩,隨后若再同時(shí)增大硫酸濃度、硫酸∶ 玉米芯廢液時(shí),提取量會(huì)略有下降。因此,最佳取值點(diǎn)應(yīng)取在L- 阿拉伯糖提取量最高點(diǎn),即L- 阿拉伯糖提取量不再顯著增高的坐標(biāo)點(diǎn)處。圖7 ～ 圖11反映出的結(jié)果與圖6類似。但是圖9中水解溫度的變化對(duì)L- 阿拉伯糖提取量交互影響不大。圖6 - 圖11可得各因素的交互作用不顯著。通過計(jì)算本實(shí)驗(yàn)的回歸方程,可得到四個(gè)因素的最佳作用值。

圖6 硫酸濃度與硫酸∶ 玉米芯廢液交互作用對(duì)L - 阿拉伯糖提取量影響的響應(yīng)面等高線圖Fig. 6 Response surface contour map for concentration of sulfuric acid and sulfuric acid∶ corncobwaste interaction on L - arabinose extraction

圖7 硫酸濃度與水解時(shí)間交互作用對(duì)L - 阿拉伯糖提取量影響的響應(yīng)面等高線圖Fig. 7 Response surface contour map for concentration of sulfuric acid and hydrolysis time interaction on L - arabinose extraction

圖8 硫酸∶ 玉米芯廢液與水解時(shí)間交互作用對(duì)L - 阿拉伯糖提取量影響的響應(yīng)面等高線圖Fig. 8 Response surface contour map for sulfuric acid∶ corncob waste and hydrolysis time interaction on L - arabinose extraction

圖9 硫酸濃度與水解溫度交互作用對(duì)L - 阿拉伯糖提取量影響的響應(yīng)面等高線圖Fig. 9 Response surface contour map for concentration of sulfuric acid and hydrolysis temperature interaction on L - arabinose extraction

圖10 硫酸:玉米芯廢液與水解溫度交互作用對(duì)L - 阿拉伯糖提取量影響的響應(yīng)面等高線圖Fig. 10 Response surface contour map for sulfuric acid∶ corncob waste and hydrolysis temperature interaction on L - arabinose extraction

圖11 水解時(shí)間與水解溫度交互作用對(duì)L - 阿拉伯糖提取量影響的響應(yīng)面等高線圖Fig. 11 Response surface contour map for hydrolysis time and hydrolysis temperature interaction on L - arabinose extraction

為了確定各因素的最優(yōu)值,利用軟件分析得L- 阿拉伯糖的含量最高的實(shí)驗(yàn)條件如表3所示:

我們通過Design - Expert. 8. 05軟件分析,最佳的分離純化工藝是硫酸濃度6. 00%,硫酸∶ 玉米芯廢液4. 01∶ 1,水解溫度100. 00℃,水解時(shí)間2. 50h,阿拉伯糖的含量可達(dá)21. 25μg·mL-1。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法的可行性,采用得到的最佳提取條件進(jìn)行L- 阿拉伯糖的含量提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),同時(shí)考慮到實(shí)際操作和生產(chǎn)的便利,以硫酸濃度6. 00%、硫酸∶ 玉米芯廢液4. 00∶ 1、水解時(shí)間2. 50h、水解溫度100. 00℃為最佳。3次平行實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際平均提取含量為20. 86μg·mL-1,與理論值相差1. 84%。因此,響應(yīng)面法對(duì)L- 阿拉伯糖含量提取條件的優(yōu)化是可行的,得到的L- 阿拉伯糖提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

根據(jù)響應(yīng)面分析可知,影響從玉米芯工業(yè)廢液中分離制備L- 阿拉伯糖的顯著工藝條件為:水解溫度、水解時(shí)間、硫酸濃度,硫酸與玉米芯工業(yè)廢液的體積比。最后確定的最佳工藝條件為水解溫度100. 00℃,紓解時(shí)間2. 50h,硫酸濃度6. 00%,硫酸與玉米芯工業(yè)廢液的體積比4. 00∶ 1,此時(shí)L- 阿拉伯糖的含量為20. 86μg·mL-1。此次探討的工藝對(duì)玉米芯工業(yè)廢液中制備L- 阿拉伯糖的提取率和純度有顯著提高。從玉米芯廢液中提取L- 阿拉伯糖的得率達(dá)到20. 86μg·mL-1對(duì)于開拓L- 阿拉伯糖的市場(chǎng)有很大前景,并對(duì)其作用機(jī)理的研究也有一定的推動(dòng)作用。

表3 響應(yīng)面分析獲得的最佳純化工藝條件Table 3 The best purification process conditions obtained from response surface analysis

[1]魏承厚,雷光鴻,張帆,等. 資源化利用磷酸制備D - 木糖和L- 阿拉伯糖的研究[J]. 輕工科技:制糖工程與技術(shù),2014,2:25 - 27.

[2]Forsman J,Leino R.L- Pentoses in biological and medicinal applications[J]. Chemical Reviews,2011,111:3334 - 3357.

[3]周春麗,劉華,李玉萍. 功能性五碳糖的生產(chǎn)及應(yīng)用研究[J]. 食品工業(yè),2013,34(5):195 - 198.

[4]Helanto M,Kiviharju K,Granstr?m T,etal. Biotechnological production of l - ribose from L - arabinose[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2009,83(1):77 - 83.

[5]陳軍,王元春. 蔗髓制備木糖、L- 阿拉伯糖的工藝優(yōu)化[J].食品科技,2011,36(11):237 - 240.

[6]周俊,徐暢,浦佳. 微生物酶解法產(chǎn)生阿拉伯糖 - 菌種篩選與初步鑒定[J]. 氨基酸和生物資源,2010,32(4):73 - 76.

[7]桂堂輝,何成新,李賜玉.L- 阿拉伯糖對(duì)降低高糖高脂喂養(yǎng)小鼠體重增長(zhǎng)速率的影響[J]. 廣西植物,2010,3(2):280 - 283.

[8]蘇會(huì)波,林海龍. 新資源食品L- 阿拉伯糖的制備、功能、應(yīng)用和市場(chǎng)現(xiàn)狀[J]. 食品工業(yè)科技,2014，35(7)：368 - 372.

[9]李雪雁,王丹,胡朝霞,等. 玉米芯酸法提取木糖的工藝改進(jìn)[J]. 食品工業(yè)科技,2009,30(6):263 - 265.

[10]詹伊婧,徐錚,許露,等.L- 核糖的生產(chǎn)研究進(jìn)展[J]. 生物加工工程,2013,11(5):74 - 78.

[11]鄒鴻菲,張澤生,鄭敏. 微生物分離玉米皮水解液中L- 阿拉伯糖的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(12):214 - 220.

[12]Kim K S,Moon C W,Park J,etal. Enantiopure synthesis of carbohydrates mediated by oxyselenenylation of 3,4 - dihydro - 2H- pyran[J]. J Chem Soc Perkin Trans,2000,1(9):1341 - 1343.

[13]Toeda K,Kawabata Y. Production of L - arabinose from corn hull and beet pulp by high pressure steaming[J]. Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology,2002,49(8):551 - 554.

[14]李令平,周娟,邱學(xué)良. 玉米皮酸解提取L- 阿拉伯糖的工藝研究[J]. 中國(guó)食品添加劑開發(fā)應(yīng)用,2009,6:139 - 142.

[15]王曉雷,徐夢(mèng)丹. 黃芪多糖中阿拉伯糖含量的測(cè)定[J]. 中成藥,2003,25(11):925 - 926.

[16]梁智. 淺析L- 阿拉伯糖化學(xué)[J]廣西輕工業(yè),2011,4:4 - 5.