磁性固定化PLA1的制備及其在脫膠應用中的研究

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(1. 哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院,黑龍江哈爾濱 150090; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

磷脂酶A1(PLA1)是Novozymes公司推出的一種微生物來源的磷脂酶,在2000年和2007年分別申請了世界專利和美國專利[1 - 2]。PLA1能特異性水解天然磷脂Sn - 1位?；?保留磷脂Sn - 2位的不飽和脂肪酸[3]。但是PLA1在過熱或強酸、強堿的條件下容易失活,而且酶不易回收等缺點都限制了其應用范圍。酶的固定化技術可以相應地提高酶的穩(wěn)定性,與游離酶相比,固定化酶對環(huán)境的抵抗力更強且反應更易于控制[4],在食品[5]等領域有著廣泛的應用前景。依據(jù)酶的性質(zhì)和用途,可將酶的固定化方法分為包埋法[6]、吸附法[7]、交聯(lián)法[8]及共價偶聯(lián)[9]四種。固定化酶的性質(zhì)與載體材料的結構有很大的關系,因此很多學者一直致力于對載體材料的研究[10]。與其它載體材料相比,磁性分子微粒作為固定化載體具有易從反應體系中分離和回收、操作簡便、成本低等諸多優(yōu)點,在生物醫(yī)學、細胞學、生物工程等領域已有著廣泛的應用[11 - 14]。

磁性高分子微粒是由磁性物質(zhì)和高分子材料復合而成,因其同時具備高分子粒子及磁性粒子的特性,從而使磁性微粒具有很多優(yōu)良特性,可以在其表面結合多種反應性功能基團(如 - OH、 - COOH、 - SH2等)或通過共價鍵來結合酶、細胞等,可對外加磁場表現(xiàn)出強烈的磁響應性,進行快速運動或分離。將酶固定在磁性高分子微粒上,可以盡可能的保持其原有的生物活性。因此,本試驗將PLA1固定在磁性Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復合粒子上,通過單因素試驗確定了最佳的固定化條件,并研究了其在大豆油脫膠中的應用以及假性失活磁性固定化PLA1的酶活再生。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

磷脂酶A1(Lactase Ultra A1) 諾維信(中國)生物技術有限公司；Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復合粒子 實驗室自制；水化大豆油 哈爾濱惠康食品有限公司,實測初始磷含量為202. 1mg/kg；其它試劑 均為分析純。

SC - 3614離心機 鄭州南北儀器設備有限公司；752型分光光度計 日本島津公司；PHS - 3C精密酸度計 上海雷韻試驗儀器制造有限公司；馬弗爐 南京寶都儀器有限公司；DF - 101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州南北儀器設備有限公司；恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；掃描電鏡(SEM) 上海米離特儀器公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 磁性固定化PLA1的制備 首先將1g的Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復合粒子置于50mL的磷酸緩沖液(0. 1mol/L,pH7. 0)中浸泡24h,磁分離后將上述浸泡后的載體加入到一定量的含0. 2%的磷脂酶的磷酸緩沖液(0. 1mol/L,pH7. 0)中,同時在45℃下攪拌反應一段時間,最后磁分離并用磷酸緩沖液(0. 1mol/L,pH7. 0)洗滌得到固定化酶。濾液和洗滌液合并,用來測定酶蛋白含量,將所得的固定化酶放置在冰箱內(nèi)4℃下保存。

1. 2. 2 磁性固定化PLA1用于大豆油脫膠 用500mL具塞三角瓶準確稱取300g水化脫膠大豆油,水浴加熱至45℃,加入45%檸檬酸及一定量的4% NaOH溶液混合均勻,加入一定量的去離子水,取一定量的干燥的磁性固定化酶先用去離子水浸泡復水后,再加入大豆油中,100r/min機械攪拌,在一定溫度條件下水浴反應一段時間,取樣進行磷含量分析[15]。

1. 2. 3 假性失活磁性固定化PLA1的酶活再生 磁性固定化PLA1長時間應用于大豆油脫膠后,相對活力下降,此時的磁性固定化PLA1已不具有對大豆毛油脫膠的有效活力,稱之為假性失活。將清洗收集的假性失活磁性固定化PLA1置于35%的叔丁醇水溶液中,在溫度50℃、超聲波功率80W的條件下浸泡90min,進行磁性固定化PLA1的酶活力再生。

1. 2. 4 正交試驗設計 將在最佳條件下制備的磁性固定化PLA1用于大豆油脫膠中,選取反應時間(A)、反應溫度(B)、磁性固定化PLA1添加量(C)和油相起始pH(D)為主要影響因素,進行正交試驗設計,選用L9(34)正交表進行試驗,確定最佳反應條件。

表1 正交試驗水平表Table 1 Orthogonal experiment level table

1. 2. 5 游離磷脂酶A1活力的測定 具體操作方法見參考文獻[16]。

1. 2. 6 磁性固定化磷脂酶A1活力測定 稱取一定質(zhì)量的經(jīng)干燥后的磁性固定化酶,經(jīng)復水后,按照1. 2. 5的方法進行相應的測定。

1. 2. 7 磁性固定化酶相對活力的計算方法

式中：A：每組中所測活力值,B：該組中最高活力值。

1. 2. 8 磷含量的測定 取經(jīng)離心后上層油樣約10g,進行含磷量分析,參照GB/T 5537 - 1985的方法。

1. 2. 9 數(shù)據(jù)分析 用Origin75進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2. 1 磁性Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復合粒子固定化PLA1條件的確定

2. 1. 1 酶液的添加量對固定化效果的影響 在固定化時間5h、pH 6. 0、酶液添加量分別為8、12、16、20、24、28mL的條件下進行固定化,測定固定化酶的相對活力,結果見圖1。

圖1 酶液添加量對磷脂酶A1固定化的影響Fig. 1 Effect of enzyme dosage on activity of magnetic immobilized PLA1

由圖1可以看出,磁性Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復合粒子固定化磷脂酶的相對活力在一定的固定化條件下,隨著酶液添加量的增加,固定化酶的活力也逐漸增大,酶液添加量達到20mL后,隨著酶液添加量的再增加,固定化酶的活力反而減小。這是因為酶溶液中存在一定量的雜蛋白,酶在負載到載體上的同時,雜蛋白也同樣負載到載體上,隨著酶液添加量的增加,雜蛋白的量也逐漸增多,從而競爭性地與載體上的環(huán)氧基反應,大量地覆蓋在載體上,抑制了酶蛋白的負載,使其催化活力降低。

2. 1. 2 pH對固定化效果的影響 在酶液的添加量20mL、固定化時間5. 0h、pH分別選取4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0和7. 5的條件下進行固定化,測定固定化酶的相對活力,結果見圖2。

圖2 pH對磷脂酶A1固定化的影響Fig. 2 Effect of pH on activity of magnetic immobilized PLA1

由圖2可以看出,隨pH增大,酶活力先緩慢上升,當pH等于6時酶活性最高,當pH大于6時,酶活力又逐漸降低。原因可能是酶和固定化載體都存在于緩沖液中,緩沖液的pH改變了酶分子和固定化載體的離子化狀態(tài),從而影響酶分子與載體的結合；另外酶作為一種蛋白質(zhì),當溶液pH超出一定值時,微觀結構就會發(fā)生變化,從而引起酶變性或失活。因此緩沖液pH是影響載體與酶蛋白結合的關鍵因素之一[17]。

2. 1. 3 固定化時間對固定化效果的影響 在酶液的添加量20mL、pH6. 0、固定化時間分別為3、4、5、6、7和8h的條件下進行固定化,測定固定化酶相對活力,結果見圖3。

圖3 固定化時間對磷脂酶固定化的影響Fig. 3 Effect of immobilized time on activity of magnetic immobilized PLA1

由圖3可以看出,開始固定化時,隨固定化時間的延長,固定化酶活力增加,5h時固定化酶活達到最高值,固定化時間繼續(xù)延長,固定化酶活力反而下降,這是由酶的失活所致。從圖3可看出,5h為最佳固定化時間。

2. 2 磁性固定化PLA1的表征分析

磁性固定化PLA1的SEM圖如圖4所示。Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復合粒子的成球性較好,直徑大約在110nm,粒徑均一,這種均勻的分散比較有利于酶的固定化。由于載體是納米級磁性微粒,粒徑較小,比表面積大,因此可以負載大量的PLA1,從圖b中可以看出,固定化效果較好,而且磁性固定化PLA1的分散性也較好,有利于其在酶促反應中的應用。

圖4 磁性固定化PLA1的SEM圖Fig. 4 SEM micrographs of magnetic immobilized PLA1

2. 3 磁性固定化PLA1在大豆油脫膠中的應用

按照表1的因素水平,采用正交選用L9(34)正交表進行試驗,確定最佳脫膠條件,正交試驗結果見表2。

表2 正交實驗結果Table 2 The orthogonal experiment result

由表2可以看出,油相起始pH對脫膠效果影響最大,其次是反應溫度、反應時間、加酶量。最適宜的脫膠條件是A2B2C3D2,即反應時間6h、反應溫度55℃、加酶量0. 12g/kg、油相起始pH6. 0。因為正交表中沒有該組試驗,所以補做這組試驗,最后得到的脫膠油中磷含量為12. 5mg/kg。

2. 4 假性失活磁性固定化PLA1的酶活再生研究

磁性固定化PLA1長時間應用于大豆油脫膠后,大豆油中磷脂酸等分子與磁性固定化PLA1表面氨基酸殘基易發(fā)生酯化結合,而在磁性固定化PLA1表面形成部分薄膜覆蓋,且在緩沖液中難以清洗掉,造成磁性固定化PLA1活性中心的空間位阻,造成磁性固定化PLA1的假性失活。在超聲波狀態(tài)下利用有機溶劑可對假性失活磁性固定化PLA1表面進行適當清洗,利用超聲波的直進流作用和空化作用,能夠打破固液平衡,有助于薄膜從磁性固定化PLA1表面解析下來,解除對磁酶表面的覆蓋,同時使假性失活磁性固定化PLA1的酶活再生。

圖5 再生磁性固定化PLA1在脫膠中的應用Fig. 5 The useness of regenerated magnetic immobilized PLA1 in degumming

如圖5所示,將再生的磁性固定化PLA1用在大豆油脫膠中,在反應16h后,脫膠油磷含量相對穩(wěn)定,酶相對活力仍在80%以上,而在第20h脫膠油磷含量明顯上升,并且磁酶相對活力下降至76. 3%,已不能有效地用于脫膠。因此,再生可以使磁性固定化PLA1的利用時間延長,降低了大豆油酶法脫膠的生產(chǎn)成本。

3 結論

以磁性Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復合粒子為載體,進行磷脂酶A1的固定化,以磁性固定化PLA1的相對活力為指標,確定了最佳的固定化條件,即酶液添加量20mL、pH6. 0、反應時間5h,在此最佳條件下制得磁性固定化PLA1酶活力最高。將該固定化酶應用于大豆油脫膠中,通過正交試驗設計確定最佳脫膠條件為：反應時間6h,反應溫度55℃,加酶量0. 12g/kg,起始油相pH6. 0。在最優(yōu)條件下進行脫膠試驗,測定脫膠油中的磷含量為12. 5mg/kg,可以有效地水解磷脂,脫膠效果較好。將再生的磁性固定化PLA1再用于大豆油脫膠中,在反應16h后,脫膠油中磷含量相對穩(wěn)定,酶相對活力仍在80%以上,延長了磁性固定化磷脂酶A1的利用時間,降低了大豆油酶法脫膠的生產(chǎn)成本。

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