基底膜蛋白多糖對成骨細胞增殖及BMP-2分泌影響

馬金龍，褚言琛，張成棟，鄒云雯

(青島大學附屬醫(yī)院骨科，山東 青島 266003)

骨折愈合是一個復雜而連續(xù)的過程，分為血腫炎癥機化期、原始骨痂形成期、骨板形成塑形期，三者之間是相互交織逐漸演進的過程，其中，成骨細胞的作用貫穿整個骨折愈合過程[1]。細胞外基質(zhì)對細胞的形態(tài)、結構、功能等具有重要的影響，而基底膜蛋白多糖是細胞外基質(zhì)的關鍵組成部分[2]，具有傳遞細胞間信號的重要作用[3]?；啄さ鞍锥嗵鞘羌毎饣|(zhì)之一，本文研究其與成骨細胞之間的關系，探討其對骨折愈合的作用，以期為骨折愈合提供理論依據(jù)。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 成骨細胞提取及培養(yǎng)

取12 h內(nèi)新生大鼠8只(不分質(zhì)量、不分雌雄，購自青島市藥物科學研究所)，25 g/L碘附常規(guī)消毒3 min，斷頭，取光滑顱骨，PBS液中浸洗后剪成直徑約0.5 mm大小的碎片，浸入2.5 g/L胰蛋白酶消化，離心，去上清液， 應用1 g/L的Ⅱ型膠原酶消化，離心，取細胞沉淀，用PBS液洗滌后濾網(wǎng)濾除雜質(zhì)，以DMEM低糖培養(yǎng)液重懸細胞，吹打后接種，培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。

1.2 成骨細胞的鑒定

應用茜素紅法(鈣化結節(jié)染色)：取第3代成骨細胞，胰酶消化完全后接種于蓋玻片上，置于6孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待接種成功后，取出蓋玻片，PBS沖洗，甲醛固定，去固定液后10 g/L茜素紅染色，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次后拍照。

1.3 細胞增殖活性檢測

取生長活躍的第3代成骨細胞，隨機分為基底膜蛋白多糖抑制劑組(A組)、空白對照組(B組)、低氧狀態(tài)下基底膜蛋白多糖抑制劑組(C組)、低氧狀態(tài)下對照組(D組)。在96孔板中每孔加100 μL配

制好的細胞懸液培養(yǎng)24 h。然后A組每孔加基底膜蛋白多糖抗體(1∶100培養(yǎng)基稀釋后)10 μL及細胞培養(yǎng)液(含體積分數(shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素以及100 mg/L鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)液)10 μL；B組每孔加20 μL細胞培養(yǎng)液；C組每孔加濃度150 μmol/L的二氯化鈷(CoCl2，細胞培養(yǎng)液稀釋)10 μL及串珠素抗體(1∶100)10 μL；D組每孔加150 μmol/L的CoCl2溶液10 μL及細胞培養(yǎng)液10 μL。另設置空白孔10個，即只有培養(yǎng)液而沒有細胞。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，每組中每個時間點增設10個檢測復孔。在每個時間點各組各孔均加入CCK溶液10 μL。然后置入培養(yǎng)箱孵育2 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)，計算細胞增殖活性。細胞增殖活性(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。A(加藥)：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液孔的吸光度；A(空白)：具有培養(yǎng)液和CCK溶液而沒有細胞孔的吸光度；A(0加藥)：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液孔的吸光度。

1.4 ELISA法檢測成骨細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)的表達

在6孔板中每孔加1 mL細胞懸液培養(yǎng)24 h后，換等量無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，按1.3方法分為A、B、C、D共4組，A組加基底膜蛋白多糖抗體100 μL及細胞培養(yǎng)液100 μL；B組加細胞培養(yǎng)液200 μL；C組加150 μmol/L的CoCl2溶液100 μL及串珠素抗體100 μL；D組加150 μmol/L的CoCl2溶液100 μL及細胞培養(yǎng)液100 μL。持續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，以3 000 r/min離心10 min，取細胞上清液。設置標準品孔和樣本孔, 用酶標儀測定450 nm波長處吸光度(A)值。通過繪制標準曲線求標本中BMP-2的濃度。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組成骨細胞增殖活性比較

隨培養(yǎng)時間增加，4組成骨細胞增殖活性均升高，差異有顯著性(F=14.62～960.06，P<0.05)。培養(yǎng)24、48 h，A組與B組比較、C組與D組比較成骨細胞增殖活性均降低，差異有顯著性(t=4.51～18.04，P<0.05)；培養(yǎng)72 h各組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

2.2 各組BMP-2表達比較

隨培養(yǎng)時間增加，4組BMP-2表達均增加，差異有顯著性(F=234.04～1 667.83，P<0.05)。培養(yǎng)24、48、72、96 h，A組與B組比較、C組與D組比較成骨細胞BMP-2表達降低，差異有顯著意義(t=6.61～30.50,P<0.05)。見表2。

表1 各組細胞增殖活性比較

表2 各組培養(yǎng)不同時間BMP-2表達比較

3 討 論

3.1 基底膜蛋白多糖對成骨細胞早期增殖的影響

細胞外基質(zhì)對細胞增殖和分化有重要的調(diào)控作用，其中很大一部分作用要通過細胞外基質(zhì)中的蛋白聚糖發(fā)揮?；啄さ鞍锥嗵鞘羌毎置诘郊毎獍l(fā)揮作用的蛋白多糖，用基底膜蛋白多糖抗體阻斷其作用的方法在理論上是可行的。有研究表明，低氧狀態(tài)下或用基底膜蛋白多糖抗體中和內(nèi)源性基底膜蛋白多糖，大鼠血管內(nèi)皮細胞增殖和對成纖維細胞生長因子的反應均降低，這可能是通過抑制黏著斑激酶(FAK)介導的信號轉導途徑實現(xiàn)的[6]。

本文的結果顯示，在成骨細胞增殖早期(48 h內(nèi))，無論是常氧狀態(tài)還是低氧狀態(tài)下，阻斷細胞外基底膜蛋白多糖后，細胞的增殖活性明顯下降，差異有顯著性，表明基底膜蛋白多糖對成骨細胞早期的增殖活性具有重要意義?；啄さ鞍锥嗵荋S側鏈與生長因子結合，調(diào)節(jié)細胞因子的活性，影響細胞的增殖[7-8]。同時，HS側鏈具有調(diào)節(jié)細胞黏附的作用，其核心蛋白與側鏈的協(xié)同作用對于細胞黏附是必需的[9]。這可能進一步影響了細胞的增殖活性。

3.2 基底膜蛋白多糖對成骨細胞晚期增殖的影響

本實驗結果顯示，在成骨細胞增殖的晚期(72 h后)，A組、C組細胞的增殖活性與B組、D組比較，差異無顯著性。細胞因子可有多種信號轉導通路，成骨細胞加入基底膜蛋白多糖抗體后再培養(yǎng)72 h，其阻斷細胞外基底膜蛋白多糖對細胞因子的影響可能通過其他通路的代償作用而減弱。而且在培養(yǎng)72 h后，成骨細胞數(shù)目逐漸增多，細胞密度較大，基底膜蛋白多糖對細胞聚集、黏附等作用的影響可能不明顯。提示其可能主要在細胞增殖的早期發(fā)揮重要作用。但低氧依然明顯影響了成骨細胞的增殖活性，說明低氧對成骨細胞的增殖影響是全面的，其原因可能涉及細胞內(nèi)、細胞外多種機制。

3.3 基底膜蛋白多糖對成骨細胞分泌BMP-2影響

研究顯示，BMP-2有促進體外培養(yǎng)的成骨細胞分化和誘導其成骨的能力。GUTIERREZ等[10]證實，BMP-2誘導C2C12細胞向成骨細胞分化時，能夠促進多種細胞外基質(zhì)中蛋白多糖的分泌，其中就包括含有HS側鏈的基底膜蛋白多糖。這說明骨髓干細胞在向成骨細胞分化過程中，BMP-2能夠增強基底膜蛋白多糖的表達。BMP-2與基底膜蛋白多糖通過互相作用進一步增強其對成骨的促進作用。本實驗結果顯示，各個時間點A組、C組成骨細胞BMP-2表達量均較B組、D組明顯降低，提示基底膜蛋白多糖對BMP-2的合成有促進作用。

綜上所述，在成骨細胞增殖早期基底膜蛋白多糖對成骨細胞增殖活性有顯著影響，并對成骨細胞分泌BMP-2具有明顯的促進作用。然而，基底膜蛋白多糖對骨折愈合的促進作用仍待進一步的研究，其臨床意義也需要進一步探討。

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