漆酶/介體體系降解黃麻纖維木質(zhì)素的研究

張勇兵， 董愛學(xué)， 周春曉， 袁久剛， 王 強(qiáng)， 范雪榮， 王 平， 崔 莉

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

黃麻纖維是一種可再生又可降解的天然纖維，有著優(yōu)良的吸放濕性和透氣性，同時(shí)，還具有抗靜電、抑菌和抗紫外線等保健功能[1， 2]。但是，黃麻纖維中木質(zhì)素含量高達(dá)16%左右，這導(dǎo)致黃麻纖維粗硬，可紡性差，長(zhǎng)期以來，黃麻纖維主要用于加工麻袋、麻布等低檔產(chǎn)品。為了提高黃麻纖維的可紡性，增加其產(chǎn)品的附加值，必須對(duì)其進(jìn)行脫膠處理。

傳統(tǒng)的化學(xué)法脫膠使用大量的化學(xué)藥品，污染嚴(yán)重，同時(shí)還存在纖維損傷等缺點(diǎn)。為了解決這些問題，環(huán)境友好的酶法脫膠得到了廣泛的研究和發(fā)展[3, 4]。漆酶是一種木質(zhì)素降解酶，在氧氣存在的條件下能夠氧化降解木質(zhì)素的酚型結(jié)構(gòu)單元[5]。同時(shí)，在某些具有傳遞電子能力的介體的作用下，漆酶對(duì)木質(zhì)素的非酚型結(jié)構(gòu)單元也有較好的降解效果[6]。由于漆酶的這種特性，使其用于麻類纖維的脫膠成為可能。何曉紅等人[7]分別使用漆酶、纖維素酶、木聚糖酶及果膠酶對(duì)黃麻進(jìn)行脫膠處理，結(jié)果表明漆酶處理是最有效的脫膠方式。顏婷婷[8]研究了漆酶/介體用于紅麻纖維的脫膠，結(jié)果顯示，經(jīng)漆酶/介體處理6 h后，紅麻纖維木質(zhì)素含量由17.82%下降到7.63%，同時(shí)，纖維的斷裂強(qiáng)度、結(jié)晶度等性能也有不同程度的改善。

目前，漆酶用于黃麻纖維脫膠的研究主要集中在木質(zhì)素的脫除效果上，關(guān)于漆酶脫膠過程中，木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)變化鮮見報(bào)道。為了闡明漆酶脫除黃麻纖維木質(zhì)素的機(jī)理，我們從黃麻纖維中提取出木質(zhì)素，然后用漆酶/介體進(jìn)行處理，通過GPC、元素分析、酚羥基的測(cè)定、紅外光譜以及核磁共振氫譜對(duì)漆酶/介體處理過程中黃麻纖維木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了分析，為漆酶/介體用于黃麻纖維的脫膠提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

黃麻織物(常熟市奧村龍?zhí)┛椩煊邢薰?；漆酶(酶活5.43 U/mg，Sigma公司)；2, 2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(Sigma公司)；二氧六環(huán)、吡啶、三氯甲烷、乙醚、乙醇、苯、濃鹽酸、冰醋酸、乙酸鈉、乙酸酐等(均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純)。

UV-2802S型紫外/可見分光光度計(jì)(美國(guó)Unico公司)，Nicolet is10傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Nicolet公司)，Wasters 1515型高效液相色譜儀(美國(guó)Wasters公司)，元素分析儀Vario ELⅢ(德國(guó)Elementar公司)，全數(shù)字化核磁共振儀Bruker Aduance Ⅲ 400MHz(德國(guó)Bruker公司)。

1.2 黃麻纖維木質(zhì)素的提取

黃麻纖維木質(zhì)素的提取參考Evtuguin等人的方法[9， 10]，并根據(jù)現(xiàn)有設(shè)備作適當(dāng)修改。稱取30 g黃麻，粉碎至40目后用苯/乙醇(體積比2∶1)溶液抽提7 h，然后風(fēng)干。將風(fēng)干后的黃麻置于500 mL的圓底燒瓶中，加入350 mL含0.2 mol/L HCl的二氧六環(huán)/水溶液(體積比9∶1)，在90℃下抽提60 min。取出燒瓶冷卻至室溫，然后抽濾。將抽濾之后的殘?jiān)僖陨厦娴臈l件抽提1次，合并2次的濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下濃縮至60 mL左右。將濃縮后的濾液加入攪動(dòng)著的800 mL的冰水中使木質(zhì)素沉淀出來，沉淀出的木質(zhì)素再用蒸餾水洗滌2次，然后冷凍干燥，得到粗制的黃麻纖維木質(zhì)素。

將上述得到的粗黃麻纖維木質(zhì)素溶于100 mL的吡啶/乙酸/水(體積比9∶1∶4)溶液中，加入120 mL CHCl3萃取，待分層后搖振，再次分層后分離其下層溶有木質(zhì)素的有機(jī)層，剩下的水層再加入70 mL CHCl3萃取，分離有機(jī)層后，合并2次萃取的有機(jī)層，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40℃下濃縮至80 mL左右。將濃縮液加入500 mL攪動(dòng)著的乙醚中使木質(zhì)素沉淀出來，沉淀出的木質(zhì)素再用乙醚洗滌至無吡啶氣味，真空干燥后得到提純的黃麻纖維木質(zhì)素。

1.3 漆酶/介體體系(LMS)處理黃麻纖維木質(zhì)素

稱取0.45 g提純后的黃麻纖維木質(zhì)素于250 mL的燒杯中，加入50 mL、pH值6的醋酸/醋酸鈉緩沖液，再加入50 U/g漆酶和0.5%(相對(duì)于木質(zhì)素)ABTS，在25℃下反應(yīng)6 h。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液離心，沉淀經(jīng)多次水洗離心后，冷凍干燥，得到LMS處理后的黃麻纖維木質(zhì)素。

1.4 黃麻纖維木質(zhì)素的乙?；?/h3>

參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)黃麻纖維木質(zhì)素進(jìn)行乙?；幚韀10]。分別稱取黃麻纖維木質(zhì)素對(duì)照樣(未處理樣)和LMS處理樣100 mg于2個(gè)棕色試劑瓶中，各加入10 mL吡啶/乙酸酐(體積比1∶2)混合液，蓋緊瓶蓋，置于暗處72 h，其間經(jīng)常搖動(dòng)以利于反應(yīng)均勻。待反應(yīng)完成后，將瓶中溶液慢慢滴入攪動(dòng)著的200 mL乙醚中，沉淀出乙?；哪举|(zhì)素，用乙醚洗滌至無吡啶氣味，真空干燥后得到乙?；狞S麻纖維木質(zhì)素。

經(jīng)乙?；幚淼狞S麻纖維木質(zhì)素，分子結(jié)構(gòu)中的羥基會(huì)轉(zhuǎn)變成為乙?；?，質(zhì)子數(shù)增加，以增強(qiáng)1H-NMR的信號(hào)強(qiáng)度。

1.5 黃麻纖維木質(zhì)素分子量的測(cè)定

將一定量黃麻纖維木質(zhì)素溶于N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中，用Waters 1515型凝膠滲透色譜儀測(cè)定其分子量及分布，色譜柱為Shodex KD-802柱，檢測(cè)器為Waters 2414示差折光檢測(cè)器，柱溫35℃，流動(dòng)相為DMF，流速1.5 mL/min，以聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)樣。

1.6 元素分析

黃麻纖維木質(zhì)素中C、H、N元素的含量用德國(guó)Vario ZLⅢ Elementar元素分析儀測(cè)定，O元素含量根據(jù)C、H、N元素的含量計(jì)算差值得到。

1.7 酚羥基含量的測(cè)定

采用紫外差示光譜法測(cè)定酚羥基含量[11]。取2.5 mg黃麻纖維木質(zhì)素于50 mL容量瓶中，以乙二醇單甲醚為溶劑，使其全部溶解，測(cè)定溶液在300 nm的吸光度，酚羥基含量按下式計(jì)算：

酚羥基(%)=黃麻纖維木質(zhì)素單位濃度的吸光度(L/g)×0.414(g/L)

1.8 紅外光譜分析

將2 mg黃麻纖維木質(zhì)素和200 mg KBr在干燥條件下混合均勻后研磨、壓片，在Nicolet is10傅里葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行測(cè)試。

1.9 核磁共振氫譜分析

將一定量乙?；狞S麻纖維木質(zhì)素溶于氘代氯仿(CDCl3)中，用Bruker Aduance Ⅲ 400 MHz核磁共振儀進(jìn)行1H-NMR測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 漆酶/介體處理后黃麻纖維木質(zhì)素分子量的變化

圖1 黃麻纖維木質(zhì)素凝膠色譜圖Fig 1 GPC of jute fiber lignins

由表1中的數(shù)據(jù)可知，經(jīng)LMS處理后，黃麻纖維木質(zhì)素的重均分子量從39105降低到31270，數(shù)均分子量從25059降低到23407，這表明黃麻纖維木質(zhì)素在LMS處理過程中發(fā)生了降解反應(yīng)。同時(shí)，黃麻纖維木質(zhì)素的多分散系數(shù)也從1.561降低到1.336，這說明經(jīng)LMS處理后，黃麻纖維木質(zhì)素中分子質(zhì)量大的部分所占比例減少，分子量分布更均一。

2.2 元素分析

表2列出了黃麻纖維木質(zhì)素對(duì)照樣和LMS處理樣的C、H、O元素含量、甲氧基含量和C9單元經(jīng)驗(yàn)式，其中甲氧基的含量通過1H-NMR推算得到，C9單元經(jīng)驗(yàn)式根據(jù)C、H、O元素含量及甲氧基含量計(jì)算得到[12]。

表2 黃麻纖維木質(zhì)素元素含量、甲氧基含量及C9經(jīng)驗(yàn)式

由表2可知，與對(duì)照樣相比，LMS處理樣中H元素百分含量降低，而氧元素百分含量升高，這可能是黃麻纖維木質(zhì)素在LMS處理過程中，發(fā)生了氧化反應(yīng)所致。甲氧基是木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要特征，經(jīng)LMS處理后，黃麻纖維木質(zhì)素中的甲氧基含量由18.05%降低至16.83%，說明在LMS處理過程中，黃麻纖維木質(zhì)素發(fā)生了脫甲氧基反應(yīng)。

2.3 漆酶/介體處理后黃麻纖維木質(zhì)素酚羥基含量的變化

根據(jù)黃麻纖維木質(zhì)素在300 nm處的吸光度，計(jì)算出木質(zhì)素中酚羥基的含量，結(jié)果見表3。由結(jié)果可知，經(jīng)LMS處理后，黃麻纖維木質(zhì)素中酚羥基含量降低，這表明在LMS氧化降解黃麻纖維木質(zhì)素過程中，酚羥基參與了反應(yīng)。

表3 黃麻纖維木質(zhì)素酚羥基含量

2.4 黃麻纖維木質(zhì)素的紅外光譜分析

黃麻纖維木質(zhì)素對(duì)照樣、LMS處理樣的紅外光譜圖見圖2。紅外光譜用于定量分析木質(zhì)素的某些官能團(tuán)時(shí)，通常采用基線法。由于1506 cm-1附近苯環(huán)骨架的伸縮振動(dòng)吸收峰比較穩(wěn)定，是木質(zhì)素紅外光譜的特征吸收，通常以此峰作為基準(zhǔn)數(shù)，其他峰的透過率與之對(duì)比，即得出該吸收峰的相對(duì)透過率。黃麻纖維木質(zhì)素經(jīng)LMS處理前后主要吸收峰及相對(duì)透過率見表4。

圖2 黃麻纖維木質(zhì)素紅外光譜圖

/cm-1LMS3443171715061423O-HC=O,C-H0.541.501.001.030.601.371.001.10

從表4中可看出，3443 cm-1處為木質(zhì)素中羥基伸縮振動(dòng)吸收峰，經(jīng)LMS處理后，該吸收峰相對(duì)透過率增大，表明LMS處理后木質(zhì)素中羥基含量有所減少。1717 cm-1處的吸收峰來自木質(zhì)素中非共軛羰基伸縮振動(dòng)，經(jīng)LMS處理后，其相對(duì)透過率降低，說明在LMS處理過程中，黃麻纖維木質(zhì)素發(fā)生了氧化反應(yīng)，生成了新的羰基。1423 cm-1處吸收峰是由木質(zhì)素中甲氧基C-H振動(dòng)引起的，經(jīng)LMS處理后，其相對(duì)透過率增大，說明LMS處理引起了黃麻纖維木質(zhì)素中甲氧基的脫除，這與前面元素分析的結(jié)果一致。

2.5 黃麻纖維木質(zhì)素的核磁共振氫譜分析

經(jīng)乙?；幚淼狞S麻纖維木質(zhì)素對(duì)照樣和LMS處理樣的1H-NMR譜圖如圖3所示。參考相關(guān)文獻(xiàn)[13， 14]，將譜圖進(jìn)行了范圍區(qū)分，并確定了每個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)的質(zhì)子歸屬。通過計(jì)算各區(qū)段信號(hào)積分面積與總積分面積的比例，可以得到木質(zhì)素各官能團(tuán)的相對(duì)質(zhì)子百分比，再根據(jù)元素分析結(jié)果計(jì)算出每C9單元的總質(zhì)子數(shù)，從而求出各特定區(qū)段的質(zhì)子數(shù)，計(jì)算結(jié)果見表5。

圖3 黃麻纖維木質(zhì)素的1H-NMR譜圖Fig 3 1H NMR spectra of jute fiber lignins

根據(jù)表5中的數(shù)據(jù)推算出黃麻纖維木質(zhì)素每C9結(jié)構(gòu)單元中醇羥基、酚羥基及總羥基的個(gè)數(shù)，結(jié)果如表6所示。

表6 黃麻纖維木質(zhì)素功能基團(tuán)含量

由表6可以看出，經(jīng)LMS處理后，黃麻纖維木質(zhì)素每C9單元中酚羥基個(gè)數(shù)、醇羥基個(gè)數(shù)及總羥基個(gè)數(shù)均減少。酚羥基含量減少，這與紫外光譜測(cè)定的結(jié)果一致；醇羥基含量減少，這可能是因?yàn)槠崦冈诮轶w的作用下能夠氧化木質(zhì)素中的醇羥基；總羥基含量減少，這和前面紅外光譜分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

1)黃麻纖維木質(zhì)素經(jīng)LMS處理后，其重均分子量、數(shù)均分子量以及多分散系數(shù)均降低，表明黃麻纖維木質(zhì)素經(jīng)LMS處理后發(fā)生降解反應(yīng)，分子量的分布更均一。

2)黃麻纖維木質(zhì)素經(jīng)LMS處理后，酚羥基、醇羥基以及甲氧基含量減少，羰基含量增加。甲氧基含量減少表明在LMS作用下，部分甲氧基發(fā)生了脫甲氧基反應(yīng)，而羰基含量增加可能是LMS處理使黃麻纖維木質(zhì)素發(fā)生氧化所致。

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