人乙醛脫氫酶2的原核表達(dá)及其活性的鑒定

黃娟 王荷花 張小驥 潘博宇 陳孝平 吳元欣

（武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過程教育部重點實驗室，武漢 430073）

人乙醛脫氫酶2的原核表達(dá)及其活性的鑒定

黃娟 王荷花 張小驥 潘博宇 陳孝平 吳元欣

（武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過程教育部重點實驗室，武漢 430073）

商品化的乙醛脫氫酶主要從動物細(xì)胞、肝細(xì)胞線粒體中提取，其來源受到很大的限制，而且價格昂貴。為了解決乙醛脫氫酶原料有限的問題，利用微生物發(fā)酵法獲取乙醛脫氫酶。 將人乙醛脫氫酶2基因（aldh2）克隆至原核表達(dá)載體pET32a中，構(gòu)建重組載體pET32a-ALDH2。將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21（DE3），用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示目的蛋白得到大量表達(dá)；且對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，在37℃，1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h為最優(yōu)表達(dá)條件。由于目的蛋白幾乎都是以包涵體形式表達(dá)，為了得到有活性的乙醛脫氫酶，對包涵體變性、復(fù)性和純化進(jìn)行了研究。試驗數(shù)據(jù)顯示，酶的最終得率為14.49 U/L。并通過用Bradford法，測定復(fù)性蛋白的濃度約為77 μg/mL，進(jìn)行活性檢測表明，該復(fù)性蛋白具有乙醛脫氫酶活性，酶活性約為1.449 U/mL。通過構(gòu)建重組載體pET32a-ALDH2和優(yōu)化表達(dá)條件，aldh2在原核表達(dá)宿主E.coli BL21（DE3）得到大量表達(dá)；此外，利用透析復(fù)性法得到的復(fù)性蛋白酶活性有所提高。

乙醛脫氫酶2 克隆 條件優(yōu)化 酶活鑒定

人體內(nèi)的乙醛脫氫酶主要有乙醛脫氫酶1（aldh1）和乙醛脫氫酶2（aldh2）兩種，乙醛的氧化主要是依靠二者來完成，而aldh2對乙醛的活性要高出aldh1的50倍［1］。aldh2是乙醛脫氫酶的一

種，是人體酒精代謝的關(guān)鍵［2］。它在人體的主要作用是將人體內(nèi)的酒精代謝后產(chǎn)生的乙醛脫氫氧化為無毒的乙酸，乙酸再進(jìn)入TCA循環(huán)代謝為二氧化碳和水。在整個代謝過程中，乙醛脫氫酶是限速酶［3］。有研究報道，乙醛對人體有致癌作用，它與人類腫瘤的發(fā)生也有關(guān)系［4］。飲酒是食道癌的危險因素之一［5-7］。當(dāng)人過量飲酒時，酒精的代謝產(chǎn)物乙醛不能及時被氧化，就會在體內(nèi)積累，容易誘發(fā)肝癌［8］。由于aldh2在代謝乙醛中催化效率最高，所以aldh2在乙醛脫氫酶的研究中受到人們更廣泛的關(guān)注。

目前，商品化的乙醛脫氫酶主要是從動物肝臟、肝細(xì)胞線粒體中提取，資源很有限且價格昂貴，大規(guī)模生產(chǎn)困難。獲得乙醛脫氫酶比較傳統(tǒng)的方法主要是從微生物體內(nèi)提取，Zarnt教授［9］利用四氫呋喃甲醇培養(yǎng)基培養(yǎng)Ralstonia eutropha，并分離純化出了乙醛脫氫酶。香港中文大學(xué)的Wing-Ping Fong和Ka-Fai Choy教授［10］提出了一種以草魚的內(nèi)臟為原材料，從其線粒體內(nèi)分離提取aldh2的方法。該方法對原料進(jìn)行勻漿混合預(yù)處理后依次通過高速離心分離，超濾濃縮并使用柱層析后得到比活為4.46 U/mg的aldh2。為了解決乙醛脫氫酶資源有限的問題，許多科研工作者都試圖從微生物的發(fā)酵來獲取大量的乙醛脫氫酶。黃坤等［11］利用畢氏酵母分泌表達(dá)aldh2時，在優(yōu)化的誘導(dǎo)條件下可制備大量aldh2，但由于酵母的生長周期比較長，所以得到的目的蛋白的活性最高只能達(dá)到0.115 U/mL。趙錦等［12］也曾嘗試過在酵母中表達(dá)乙醛脫氫酶，經(jīng)分離純化后的乙醛脫氫酶液的酶活為0.994 U/mL。由于受酵母本底表達(dá)的影響，導(dǎo)致乙醛脫氫酶的表達(dá)量很少，而且表達(dá)出來的酶活性較低。

本研究通過更換表達(dá)載體和宿主菌來提高乙醛脫氫酶的表達(dá)量，即用原核表達(dá)載體pET32a在原核表達(dá)宿主E.coli BL21（DE3）中表達(dá)乙醛脫氫酶，并對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。由于目標(biāo)蛋白是以包涵體的形式表達(dá)，為了得到有活性的蛋白，所以對包涵體變性、復(fù)性和純化，并對復(fù)性蛋白的活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 高保真酶Pyrobest DNA Polymerase，限制性內(nèi)切酶Nde I、Pst I、Xho l、Sma I、EcoR V、EcoR I、T4 DNA Ligase、1 kb和500 bp DNA Marker購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生物公司；瓊脂糖凝膠、低溶點瓊脂糖凝膠、IPTG、TEMED購自Sigma公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、丙烯胺購自北京普利萊公司；巰基乙醇、β-NAD、BSA購自Amresco公司；Ni-NTA Agarose購自Invitrogen公司。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 用于分子克隆的宿主E.coli DH5α，用于表達(dá)的宿主E.coli BL21（DE3）由本實驗室保存。原核克隆載體pBluescriptSKII和原核表達(dá)載體pET32a本實驗室保存。帶有aldh2基因的克隆載體pUC57-6His-ALDH2由本實驗室構(gòu)建保存。LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L；固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉）用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1.1 重組載體pBluescriptSKII-aldh2的構(gòu)建 以pUC57-6His-aldh2為 模 板，P1（5'-AAACATATGTCAGCCGCCGCCACCCAG-3'），P2（5'-AAACTCGAGTGAGTTCTTCTGAGGCACTTT-3'）為引物，PCR擴(kuò)增aldh2片段，再用低熔點膠回收目的片段［13］。將堿裂解法［14］提取的質(zhì)粒pBluescriptSKII用限制性內(nèi)切酶EcoR V作單酶切后，低熔點膠回收?；厥蘸蟮哪康钠魏洼d體用T4連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選重組子［15］。對陽性重組子進(jìn)行藍(lán)白斑初選后，為了進(jìn)一步確認(rèn)陽性結(jié)果，對其中一個菌做酶切鑒定。

1.2.1.2 表達(dá)載體pET32a-aldh2的構(gòu)建 將質(zhì)粒pBluescriptSKII-aldh2和表達(dá)載體pET32a分別用限制性內(nèi)切酶Nde 1和Xho I雙酶切，將切下的1 500 bp目的片段和載體pET32a片段用低熔點膠回收后，再用T4連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的菌種涂于含氨芐青霉素的平板，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落用PCR菌落法［16］篩選重組子，再進(jìn)行酶切鑒定及DNA測序驗證。

1.2.2 原核表達(dá)載體pET32a-aldh2的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL的AMP），37℃過夜培養(yǎng)，用堿裂解法提取質(zhì)粒。重組

質(zhì)粒pET32a-aldh2轉(zhuǎn)化100 μL BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建工程菌。

取1 mL過夜培養(yǎng)的工程菌至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，待OD600nm=0.5時，分別加入終濃度為0.1、0.5和1.0 mmol/L IPTG，30℃和37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。將菌液離心，棄上清，用PBS緩沖液重懸菌體，在沸水中煮10 min。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測aldh2是否表達(dá)。

1.2.3 乙醛脫氫酶活性的研究

1.2.3.1 收集包涵體 取2 mL過夜培養(yǎng)的工程菌接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，待OD600nm=0.5時，加入IPTG的終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，離心棄上清，用PBS緩沖液洗滌菌體3次后，20 mL PBS緩沖液重懸細(xì)菌，在超聲波破碎儀下破碎25 min（功率300 W，工作2 s，間歇4 s），然后于4℃ 1 200 r/min下離心30 min棄上清，包涵體洗滌緩沖液洗滌兩次后再用蒸餾水洗滌兩次，離心，收集包涵體。

1.2.3.2 包涵體的變性、復(fù)性和純化 將收集的包涵體溶于4 mL包涵體溶解緩沖液（8 mol/L脲，50 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH8.0）中，室溫振蕩1 h，離心15 min收集上清。對于變性蛋白的復(fù)性，采取了透析復(fù)性法：上清放入預(yù)先處理好的透析袋中，依次將透析袋放入6、4、3、2以及1 mol/L尿素復(fù)性緩沖液中，分別在4℃下透析3 h。最后在PBS緩沖液中過夜透析，收集復(fù)性蛋白。由于表達(dá)載體pET32a帶有6His融合標(biāo)簽，所以本試驗用Ni-NTA樹脂純化重組蛋白。將透析復(fù)性的蛋白經(jīng)過預(yù)先處理的鎳柱，在4℃下結(jié)合1 h，再用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫柱子，收集洗脫液（含目的蛋白）做電泳檢測。

1.2.3.3 重組蛋白的酶活檢測 采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測定粗酶液中蛋白的含量。由于NAD+、NADH分別在260 nm、340 nm處有最大的吸收峰，故酶、輔酶NAD+和底物在一定條件下反應(yīng)，通過測定一定時間340 nm吸光度的變化值，可以計算出NAD+轉(zhuǎn)化為NADH的量，根據(jù)酶活的定義計算得到該酶的酶活。酶活性測定方法見文獻(xiàn)［17］，測定體系是對Okibe反應(yīng)體系［18］的改進(jìn)，按表1設(shè)計酶活測定體系。

表1 酶活測定反應(yīng)體系

最后加入酶液后，立即混勻，迅速倒入比色皿中，在340 nm處測定光吸收變化值（每分鐘測定一個吸光值）。酶活的定義：最適條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物為1個活力（U），可得到反應(yīng)體系里ALDH2的酶活計算公式為：

2 結(jié)果

2.1 乙醛脫氫酶2（aldh2）基因的克隆

以pUC57-6His-aldh2為模板，上述設(shè)計的P1、P2為引物，擴(kuò)增aldh2片段，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)1 500 bp處有明顯的條帶（圖1），與預(yù)期的aldh2基因大小一致。

圖1 aldh2基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 pBluescriptSKII-aldh2重組子的篩選及酶切鑒定

將擴(kuò)增的aldh2片段和經(jīng)EcoR V酶切的pBluescriptSKII用低熔點膠回收后，16℃過夜連接，

再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布于有IPTG和X-gal的篩選平板上，過夜培養(yǎng)。挑取白斑分別做兩組酶切，即Sma I單酶切，Nde I和Xho I雙酶切，鑒定為陽性克?。▓D2）。

圖2 重組載體pBluescriptSKII-aldh2構(gòu)建（A）及酶切鑒定圖（B）

2.3 pET32a-aldh2重組子的篩選及酶切鑒定

將用菌落PCR鑒定的陽性重組子pET32a-aldh2分別做兩組酶切，即Pst I單酶切，Nde I和Xho I雙酶切，試驗結(jié)果與預(yù)期一致，鑒定為陽性克?。▓D3）。將重組子測序，以T7 Promoter Primer為引物。對測序結(jié)果進(jìn)行分析，測得序列與NCBI上公布的aldh2基因序列一致。測序結(jié)果表明，aldh2基因已成功構(gòu)建到pET32a載體上。

圖3 重組載體pET32a-aldh2構(gòu)建（A）及酶切鑒定圖（B）

2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

2.4.1 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 分別從溫度和IPTG濃度兩個因素來優(yōu)化表達(dá)條件。離心收集菌體，SDS-PAGE檢測分析全菌蛋白的表達(dá)，如圖4所示，幾組不同的誘導(dǎo)條件，全菌蛋白中均含有大約為55 kD誘導(dǎo)蛋白，與預(yù)期的乙醛脫氫酶的分子量一致。隨著IPTG濃度的增加，乙醛脫氫酶的表達(dá)量明顯增多，且37℃表達(dá)組明顯優(yōu)于30℃表達(dá)組。而且試驗還從誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化，在37℃，IPTG濃度為1.0 mmol/L，分別對誘導(dǎo)表達(dá)2、4、6和8 h的蛋白進(jìn)行電泳檢測分析（圖5），隨著誘導(dǎo)時間的增加，蛋白的表達(dá)量也隨之增加。

2.4.2 重組蛋白的純化 由于目的蛋白是以包涵體的形式表達(dá)，所以要得到具有生物活性的乙醛脫氫酶，需要對包涵體進(jìn)行變性，復(fù)性和純化才能檢測其活性。將收集的包涵體溶于適量包涵體溶解緩沖液后，離心收集上清液，即得到變性的重組蛋白。變性的重組蛋白采用透析復(fù)性法復(fù)性后，收集復(fù)性蛋白。再將復(fù)性蛋白經(jīng)過預(yù)先處理的鎳柱，4℃下結(jié)合1 h，分別用10、20、40、60、80、100和200 mmol/L 咪唑洗脫液洗柱，并收集洗脫液。如圖6所

示，當(dāng)咪唑的濃度為60 mmol/L時，目的蛋白開始被洗脫，且隨著咪唑濃度的增加蛋白被大量洗脫。將圖中6-9號的洗脫液合并，得到粗酶液。為除去粗酶液中的鹽離子，將其在60 mmol/L咪唑緩沖液中4℃過夜透析。

圖4 不同誘導(dǎo)表達(dá)條件的電泳圖

圖5 不同誘導(dǎo)時間下的蛋白表達(dá)量

圖6 目標(biāo)蛋白在不同濃度咪唑洗脫液中的分布

2.5 重組蛋白的酶活性檢測

試驗對透析復(fù)性法得到的重組蛋白進(jìn)行酶活性測定。在酶活測定體系中，總反應(yīng)體系為3 mL，加入的酶液為10 μL，每分鐘讀取1次A340，以O(shè)D340對反應(yīng)時間作圖（圖7）。

圖7 蛋白酶活性測定

取反應(yīng)曲線的5-10 min內(nèi)，計算每分鐘內(nèi)OD340的減少值。根據(jù)活力單位U的定義（最適條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物為1個活力單位），計算A340的變化約為0.03 mim-1，則反應(yīng)體系里ALDH2的酶活為10 μL的原酶液里有0.014 49 U，那么得到粗酶液的酶活為1.449 U/mL。最終得到的粗酶液為2 mL，發(fā)酵液的總體積為200 mL，則酶的最終得率為14.49 U/L，即每單位體積發(fā)酵液中活得的酶活力。

3 討論

在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，大部分表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動子控制目的基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動子能控制基因在特定時期、特定部位表達(dá)，這既避免了目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)對宿主細(xì)胞生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標(biāo)產(chǎn)物的降解。本試驗采用pET32a表達(dá)載體，在IPTG誘導(dǎo)下目的蛋白得到大量表達(dá)。此外，表達(dá)載體上帶有6個組氨酸標(biāo)簽，有利于下游蛋白的純化。由于目的蛋白是以包涵體形式表達(dá)，試驗對包涵體的變性，復(fù)性和純化做了研究，并對復(fù)性蛋白的酶活性進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果有以下兩點：（1）對于重組蛋白的復(fù)性，嘗試了稀釋復(fù)性法、透析復(fù)性法和柱上復(fù)性法，但結(jié)果顯示透析復(fù)性法得到的乙醛脫氫酶活性要高于其他兩種方法。（2）通過酶活性檢測，復(fù)性后蛋白的活力為1.449 U/mL，而趙錦等在酵母中表達(dá)乙醛脫氫酶，經(jīng)分離純化后的乙醛脫氫酶液的酶活為0.994 U/mL。本試驗中發(fā)酵液總體積為200 mL，得到的粗酶液為2 mL，則酶的最終得率為14.49 U/L。其他研究人員利用酵母表達(dá)并分離純化了乙醛脫氫酶，酶的最終得率僅為11.35 U/L［19］，并且該酶的表達(dá)量偏低［11］，可能原因是：（1）酵母表達(dá)的外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的聚集造成分泌蛋白減少［20］；（2）

酵母發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH值的變化使得酵母蛋白酶的活性較強(qiáng)，從而導(dǎo)致了外源蛋白的降解［21，22］。本試驗獲得了較高的乙醛脫氫酶的酶活力和表達(dá)量，所以運(yùn)用基因工程表達(dá)乙醛脫氫酶，原核表達(dá)系統(tǒng)要優(yōu)于酵母表達(dá)。但是原核表達(dá)乙醛脫氫酶時，雖然優(yōu)化了多種表達(dá)條件（如溫度，IPTG濃度，培養(yǎng)時間，振蕩速度等），均無法獲得可溶性的表達(dá)產(chǎn)物（結(jié)果未展示），而采用變性和復(fù)性的技術(shù)手段不可避免的導(dǎo)致酶活性的損失和得率的下降。更換表達(dá)載體或者進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)，可能是解決原核表達(dá)乙醛脫氫酶形成包涵體的有效途徑之一。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression and Activity Assay of Human Aldehyde Dehydrogenase2 in Escherichia coli

Huang Juan Wang Hehua Zhang Xiaoji Pan Boyu Chen Xiaoping Wu Yuanxin
（School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education，Wuhan 430073）

The commercial acetaldehyde dehydrogenase is mainly extracted from animal cell and hepatocellular mitochondria. Source is limited and the cost is high. So the micobiological fermentation was used to obtain large amounts of aldh2, which had been cloned into the expression vector pET32a with 6His tag that was advantageous to purify the recombinant protein by nickel-chelate chromatography, then the recombinant was transformed into E.coli BL21（DE3）. After induced by IPTG, the recombinant protein had been expressed and their molecular masses were determined to be approximately 55 kD by SDS-PAGE. Through the optimization of inducing expression conditions, the results showed that the condition（37℃, 1.0 mmol/L IPTG, induced for 6 h）is the optimal. Because all target protein were almost expressed in the form of inclusion body, the bioactive acetaldehyde dehydrogenase was obtained by means of degeneration, purification and renaturation for the inclusion body, and measured the concentration of the renaturated protein by the Bradford method that was 77 μg/mL. Experimental data showed that the final yield of enzyme was 14.49 U/L. Activity tests showed that the protein has the acetaldehyde dehydrogenase activity of about 1.449 U/ mL. By constructing a recombinant vector pET32a-ALDH2 and optimizing the expression condition, aldh2 in prokaryotic expression host get a lot of expression. In addition, the activity of renaturation protein was improved by the dialysis renaturation method.

aldh2 Cloning Condition optimization Activity assay

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.034

2014-05-26

國家自然科學(xué)基金項目（81172178）

黃娟，女，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵及下游產(chǎn)物的分離；E-mail：huangjuan412@foxmail.com

吳元欣，男，博士，教授，研究方向：微生物發(fā)酵及下游產(chǎn)物的分離；E-mail：wyx@mail.wit.edu.cn