LKB1和血管內(nèi)皮生長因子在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

黃悅 夏雷 莫伏根 徐新宇

LKB1和血管內(nèi)皮生長因子在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

黃悅 夏雷 莫伏根 徐新宇

目的探討LKB1和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在胃癌中的表達(dá)及臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)（SP）法檢測115例胃癌組織和20例胃正常組織中LKB1和VEGF的表達(dá)，并探討其與胃癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren's分型及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果LKB1在胃癌組織中的陽性率為20.9%，低于正常胃組織中的95.0%（P＜0.01）；VEGF在胃癌組織中的陽性率為64.3%，高于正常胃組織中的5.0%（P＜0.01）。LKB1在胃癌組織中的低表達(dá)與胃癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren's分型及預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）；VEGF在胃癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論LKB1的低表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，對胃癌惡性生物學(xué)行為的評估及預(yù)后判斷具有重要的指導(dǎo)意義。

胃癌；LKB1；血管內(nèi)皮生長因子；免疫組織化學(xué)

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居我國惡性腫瘤的前二位［1］，胃癌的發(fā)生和發(fā)展涉及到多種基因、多種分子，故在基因水平上找尋新的預(yù)后指標(biāo)對胃癌的研究有著深刻的意義。LKB1又被稱為STK11（serine theronineprotein kinase 11），是一種抑癌基因，編碼一種絲氨酸?蘇氨酸蛋白激酶，與細(xì)胞生長和凋亡、細(xì)胞周期改變、細(xì)胞極性的維持和胚胎血管發(fā)育密切相關(guān)，其缺失、突變參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在腫瘤的血管生成中起著關(guān)鍵作用，VEGF是目前所知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子。本研究通過檢測LKB1和VEGF在人胃癌組織中的表達(dá)，觀察LKB1與VEGF之間的關(guān)系，進(jìn)而探討其在胃癌生長和轉(zhuǎn)移過程中的作用及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 115例胃癌標(biāo)本，均為江蘇省腫瘤醫(yī)院2006年1～12月手術(shù)切除標(biāo)本，且病理證實(shí)為原發(fā)性胃癌。患者男73例，女42例，年齡37～80歲（中位年齡61歲）。20例胃正常組織取自于距癌組織＞5 cm的切緣正常黏膜組織?；颊咝g(shù)前均無輔助化療或內(nèi)分泌治療史。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，同時(shí)依據(jù)病人病變部位、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Lauren's分型及有無神經(jīng)脈管侵犯進(jìn)行分組。

1.2 方法 所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林溶液固定、石蠟包埋、連續(xù)4μm切片，分別進(jìn)行HE和SP免疫組化染色。檢測所用特異性一抗為鼠抗人LKB1單克隆抗體ab15095（美國Abcam公司產(chǎn)品），工作濃度1∶100；鼠抗人VEGF單克隆抗體（上海長島生物技術(shù)有限公司）工作濃度1∶200。采用免疫組化SP法染色，石蠟切片脫蠟、水化、自來水沖洗。根據(jù)第一抗體要求對組織進(jìn)行相應(yīng)的抗原修復(fù)。PBS沖洗3次，每次3 min，滴加第一抗體，4℃過夜。PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS，滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3min，除去PBS，滴加新鮮配制的DAB顯色試劑顯色。自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，PBS返藍(lán)。經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。染色過程中設(shè)陽性和陰性對照。陽性對照用已知陽性切片，陰性對照用PBS代替一抗。

1.3 結(jié)果判斷 對免疫組化結(jié)果進(jìn)行雙盲閱片，參照Kountourakis等［3］的研究標(biāo)準(zhǔn)：LKB1以胞漿或胞核有棕黃色顆粒沉著為陽性，VEGF以胞漿有棕黃色顆粒沉著為陽性；判斷標(biāo)準(zhǔn)：－：無染色或者＜10%腫瘤細(xì)胞表達(dá)；＋：＞10%輕微或者幾乎很少部分表達(dá)；＋＋：全部細(xì)胞膜弱到中度染色或者＞10%胞漿弱到中度表達(dá)；＋＋＋：＞10%腫瘤細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)。我們以＋＋、＋＋＋作為有表達(dá)（陽性），＋、－作為無表達(dá)（陰性）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；采用Kap?lan?Meier法繪制生存曲線，相關(guān)分析采用Spearmen相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LKB1和VEGF在胃組織中的表達(dá) LKB1和VEGF在正常胃黏膜組織及胃癌中的表達(dá)情況見表1。其中，LKB1在胃癌組織中的陽性率為20.9%，低于正常胃組織中的95.0%（P＜0.01），VEGF在胃癌組織中的陽性率為64.3%，與在正常胃黏膜組織的表達(dá)（5%）存在差異（P＜0.01）。

表1 LKB1及VEGF在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況（n）

2.2 胃癌組織中LKB1及VEGF的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 LKB1在胃癌組織中的表達(dá)程度與胃癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren's分型有關(guān)（P＜0.05或0.01）；VEGF在胃癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)（P＜0.05或0.01）。見表2。

表2 胃癌組織中LKB1及VEGF的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系（n＝115）

續(xù)表

2.3 胃癌組織中LKB1及VEGF表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)分析顯示，胃癌組織中LKB1及VEGF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.199，P＜0.05）

LKB1＋－VEGF＋11 63－13 28

2.4 胃癌組織中LKB1及VEGF的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 Kaplan?Meier回歸分析顯示，LKB1及VEGF的表達(dá)與預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.05）；見圖1。

3 討論

1998年由Hemminki等采用定位候選克隆的方法從黑斑息肉綜合征（Peutz?Jeghers syndrome PJS）患者的血細(xì)胞中克隆出LKB1［4］。LKB1定位于人19p13.13，cDNA全長2158 bp，編碼區(qū)1302 bp，有9個(gè)外顯子。編碼的LKB1為一種60 kD的由433個(gè)氨基酸組成的絲氨酸?蘇氨酸蛋白激酶，含有一個(gè)激酶區(qū)域（位于50～337密碼子），其N端含有一個(gè)核定位信號(hào)區(qū)和胞漿定位區(qū)。LKB1在細(xì)胞內(nèi)分布較廣泛，在胎兒和成人的所有組織中均有表達(dá)，且在成人以上皮、睪丸生精小管和肝臟中表達(dá)最強(qiáng)。LKB1的主要功能是通過使細(xì)胞周期阻滯在G1期而抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［5］。此外，LKB1在調(diào)節(jié)胚胎血管形成以及細(xì)胞極性的誘導(dǎo)等方面也有著重要的生物學(xué)意義［6］。目前認(rèn)為，LKB1的功能異常不僅是PJS的致病因素，同時(shí)它還是一個(gè)重要的抑癌基因［7］。

LKB1的胚系突變或體細(xì)胞突變廣泛存在于多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，其作用機(jī)制可能與LKB1的胚系突變或體細(xì)胞突變，形成破壞LKB1活性的截短蛋白，產(chǎn)生一種失活的絲氨酸?蘇氨酸蛋白激酶有關(guān)［8］；當(dāng)LKB1突變和丟失后，其編碼的蛋白質(zhì)失去其生物學(xué)活性，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。LKB1的突變更容易誘發(fā)肺癌的發(fā)生，在所有肺癌組織類型中包括小細(xì)胞肺癌都存在LKB1的突變表達(dá)。LKB1在腫瘤組織中的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于正常對照組，且高度惡性組中的表達(dá)強(qiáng)度低于低度惡性組［9］。Safe等［10］進(jìn)一步證實(shí)了LKB1基因突變所致的功能缺失，導(dǎo)致了促進(jìn)肺癌新生血管形成的VEGF及其轉(zhuǎn)錄因子SP1表達(dá)水平的升高，從而促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。Matsumoto等［11］研究發(fā)現(xiàn)LKB1突變產(chǎn)生的截短蛋白在肺癌組織陽性表達(dá)率為33%，且Ⅳ期肺癌組織中LKB1突變的陽性率明顯高于Ⅰ期肺癌。Ghaffar等［12］對胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液腺癌進(jìn)行研究證實(shí)：胰腺癌中同樣存在LKB1基因突變、丟失，其雜合性丟失率為32%，雙等位基因失活率為9%，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LKB1基因早期突變、丟失易促進(jìn)腫瘤形成，晚期丟失則促進(jìn)惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究中，LKB1在胃癌組織中的陽性率為20.9%，明顯低于正常胃黏膜組織的95.0%（P＜0.01），且LKB1在胃癌組織中的表達(dá)程度與胃癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren's分型及預(yù)后有關(guān)（均P＜0.05）。由此，我們認(rèn)為LKB1蛋白的缺失表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

圖1 LKB1及VEGF的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

LKB1抑癌作用的機(jī)制可能與其負(fù)性調(diào)節(jié)VEGF有關(guān)［10］，LKB1能夠下調(diào)VEGF的表達(dá)，對腫瘤新生血管產(chǎn)生抑制作用，從而達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。VEGF是控制血管新生的信號(hào)因子，其正常調(diào)控在胚胎發(fā)育和低氧應(yīng)激中有重要意義。研究表明，LKB1可以調(diào)節(jié)VEGF的水平。LKB1敲除的老鼠胚胎期即死亡，并伴隨血管發(fā)育異常和VEGF表達(dá)量的明顯上調(diào)，而且，過表達(dá)LKB1可下調(diào)VEGF的水平［13］。由于血管生成是實(shí)體瘤生長所必需的，上述調(diào)控關(guān)系說明了LKB1調(diào)節(jié)VEGF對抑制腫瘤生長的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在LKB1與肺腺癌及乳腺癌發(fā)生的關(guān)系中，LKB1基因突變或缺失可造成胚胎血管發(fā)育異常，且能上調(diào)胚胎纖維母細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，而VEGF過度表達(dá)提示正常組織癌變，這對肺癌及乳腺癌的診斷起重要的指導(dǎo)意義［14］。本研究所顯示的胃癌組織中LKB1及VEGF表達(dá)的負(fù)相關(guān)（r＝－0.199，P＜0.05），提示LKB1蛋白可能通過下調(diào)胃癌組織中VEGF的表達(dá)，抑制胃癌新生血管產(chǎn)生，從而對胃癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展起抑制作用。

綜上所述，LKB1可能通過下調(diào)胃癌組織中VEGF的表達(dá)，抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展。LKB1基因的低表達(dá)可能是胃癌預(yù)后不良的重要危險(xiǎn)因素。隨著對LKB1的深入研究，為胃癌等惡性腫瘤的診斷和治療提供新的科學(xué)依據(jù)，并有望為胃癌的基因治療、腫瘤抑制劑的研發(fā)提供新的作用靶點(diǎn)。

［1］ 夏雷，莫伏根，李剛，等.胃癌中HER?2和HER?3的表達(dá)及臨床意義［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2013，27（11）：903?907.

［2］ Ylikorkala A，Rossi DJ，Korsisaari N，et al.Vascular ab?normalities and deregulation of VEGF in Lkb12 deficient mice［J］.Science，2001，293（5533）：1323?1326.

［3］ Kountourakis P，Pavlakis K，PsyrriA，etal.Prognostic sig?nificance of HER3 and HER4 protein expression in colorectal adenocarcinomas［J］.BMC Cancer，2006，28（6）：46.

［4］ Hemminki A，Markie D，Tomlinson I，etal.A serine／threo?nine kinase gene defective in Peutz?Jeghers syndrome［J］. Nature，1998，391（6663）：184?187.

［5］ Baas AF，Smit L，Clevers H.LKB1 tumor suppressor protein：PAR taker in cell polarity［J］.Trends Cell Biol，2004，14（6）：312?319.

［6］ Katajisto P，Vaahtomeri K，Makela TP，et al.LKB1 signaling in mesenchymal cells required for suppression of gastrointestinal polyposis［J］.Nat Genet，2008，40（4）：455?459.

［7］ Zhang S，Schafer?Hales K，Khuri FR，etal.The tumor supp ressor LKB1 regulates lung cancer cell polarity bymediating ode42 recruitment and activity［J］.Cancer Res，2008，68（3）：740?748.

［8］ McGarrity TJ，Amos C.Peutz?Jeghers syndrome：clinicopa?thology and molecular alterations［J］.Cell Mol Life Sci，2006，63（18）：2135?2144.

［9］ Slack?Davis J，Dasilva JO，Parsons SJ.LKB1 and Src：an?tagonistic regulators of tumor growth and metastasis［J］. Cancer Cell，2010，17（6）：527?529.

［10］Safe S，Abdelrahim M.Sp transcription factor family and its role in cancer［J］.Eur J Cancer，2005，41（16）：2438?2448.

［11］Matsumoto S，Iwakawa R，Takahashi K，et al.Prevalence and specificity of LKB1 genetic alterations in lung cancers［J］.Oncogene，2007，26（40）：5911?5918.

［12］Ghaffar H，Sahin F，Sanchez Cespedes M，etal.LKB1 pro?tein experssion in the evolution of glandular neoplasia of the lung［J］.Cancer Res，2003，63（15）：2998?3003.

［13］Zhuang ZG，DiGH，Shen ZZ，etal.Enhanced expression of LKBI in breast cancer cells attenuates angiogenesis，invasion，and metastatic potential［J］.Mol Caneer Res，2006，4（11）：843?849.

［14］程忠強(qiáng)，詹曉東.LKB1在腺癌中研究進(jìn)展［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2010，2（8）：224?225.

Clinical significance of the expression of LKB1 and vascular endothelial grow th factor in gastric cancinoma

HUANG Yue．Department of Pathology，Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210006，China；XIA Lei，MO Fu?gen，XU Xin?yu．Department of Pathology，Jiangsu Cancer Hospital，Nanjing 210009，China

ObjectiveTo investigate the expression of LKB1 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in hu?man gastric cancer tissue and to investigate the clinical significance.M ethodsThe expressions of LKB1 and VEGF in 115 cases of gastric carcinoma and 20 cases of normalgastric tissueswere detected with immunohistochemistrymethod，and the relationship of the expression of LKB1 and VEGF with the clinicopathological parameters of gastric carcinoma was ana?lyzed.ResultsThe positive rate of LKB1 in gastric carcinoma and normal tissueswas 20.9%and 95.0%，respectively（P＜0.01）.The positive rate of VEGF in gastric carcinoma and normal tissues was 64.3%and 5.00%，respectively（P＜0.05）.The low expression of LBK1 was associated with tumor lymph node metastasis，stage，Lauren's classification and worse survival（P＜0.05）；The expression of VEGFwas associated with tumor lymph nodemetastasis，stage，distantmetas?tasis and worse survival（P＜0.05）.ConclusionsLow expression of LKB1 proteinmay play an important role in the de?velopment and progression of gastric cancer.LKB1may be used to assess themalignantbiological behavior and prognosis of gastric cancer.

gastric cancer；LKB1；vascular endothelial growth factor；immunohistochemistry

R 735.2

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.09.009

2013?12?13）

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2012874）

210006江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院病理科（黃悅）；210009江蘇省南京市，江蘇省腫瘤醫(yī)院病理科（夏雷，莫伏根，徐新宇）

徐新宇，Email：redxxy＠163.com