NLRP3與心血管疾病關聯(lián)的研究進展

郭志浩，王莉娜，馬根山

(東南大學附屬中大醫(yī)院心血管內科，江蘇南京 210009)

近來，細胞分子生物學研究發(fā)現(xiàn)了炎癥小體的結構及生理作用。炎癥小體由核苷酸結合寡聚化結構域蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)、NOD羧基端的亮氨酸富集(leucine-rich repeats，LRRs)結構域以及NOD氨基端效應器三部分組成。效應器分為熱蛋白結構域(pryin domain，PYD)、胱冬肽酶募集結構域(caspase recruitment domain，CARD)以及BIR(baculovirus inhibitor of an apoptosis protein repeat)結構域。根據(jù)氨基端效應器的不同，炎癥小體分為NLRPs(含 PYD)、NLRC(含 CARD)以及 NAIP(含 BIR結構域)。NLRP3屬于NLRPs，為目前研究最多的炎癥小體。NOD具有ATP依賴的寡聚化特性，為半胱天冬酶-1(caspase-1)的募集和活化提供平臺。LRRs結構域識別致病原后發(fā)生變構，激活NOD，并暴露PYD。PYD通過募集ASC激活半胱天冬酶-1［1］。

NLRP3可被多種配體(如DAMPs、PAMPs以及外源性分子，十二烷基硫酸鈉、鋁、硅等)激活［1］。目前有3種較有說服力的NLRP3激活模型。(1)溶酶體的溶解:巨噬細胞中的溶酶體失穩(wěn)，釋放蛋白酶，激活NLRP3［2］;(2)活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成:ROS誘導硫氧還蛋白(thioredoxin，TXN)解離出硫氧還蛋白作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)，TXNIP 激活 NLRP3［3］;(3)ATP 依賴的 K+外流:ATP活化嘌呤P2X7受體，活化的P2X7受體激活NLRP3。此過程中，K+濃度降低對激活NLRP3是必要的［4］。K+似乎是所有激活方式的共同通路:K+外流可能促進NLRP3組分的變構以及組裝。NLRP3被激活后通過PYD募集ASC，進而激活半胱天冬酶-1，隨后半胱天冬酶-1促進釋放白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素 18(interleukin-18，IL-18)而進一步發(fā)揮促炎癥作用［5］。

NLRP3參與人體對病原的急性反應，反應不足或過度均會造成不必要的損害。因此，維持人體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)需要高度協(xié)調的NLRP3反應。NLRP3的激活、表達水平、組分的異常以及編碼組分的基因突變都可以影響NLRP3介導的炎癥反應，影響疾病的發(fā)生發(fā)展。

1 NLRP3在心血管疾病中的作用

1.1 NLRP3在冠狀動脈粥樣硬化(冠脈硬化)中的作用

NLRP3在冠脈硬化的早期即發(fā)揮作用。低密度脂蛋白促膽固醇結晶沉積于血管壁。巨噬細胞將其吞噬后轉化為泡沫細胞。泡沫細胞通過下列機制活化NLRP3，始動炎癥反應，最終形成循環(huán)作用:(1)巨噬細胞中吞噬溶酶體包含ROS，溶酶體破裂釋放ROS以及蛋白酶激活NLRP3［2-3］。(2)位于包膜的Toll樣受體(toll-like recepter，TLR)-12/Toll樣受體-4識別諸如弱氧化修飾脂蛋白(minimally oxidized LDL)、游離脂肪酸，通過募集髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)和干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)后誘導核因子-κB(NF-κB)產生。NF-κB促進胞內的NLRP3基因表達以及IL-1β前體產生，協(xié)同促進炎癥反應［6］。(3)促炎癥因子誘導巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞的浸潤和活化，導致細胞死亡及胞外膽固醇和纖維素的堆積，促進磷酸鈣結晶沉積。沉積的結晶鈣進一步使巨噬細胞中溶酶體破裂［2］。(4)IL-1β募集單核細胞、激活血小板，促進IL-1β釋放［7］。(5)活化的巨噬細胞生成IL-18引起更多的血管平滑肌細胞壞死，釋放組織金屬蛋白酶，降低斑塊的穩(wěn)定性［8］。上述機制形成循環(huán)反應，使得斑塊體積增大及穩(wěn)定性下降。

1.2 炎癥小體在缺血以及缺血/再灌注(I/R)中的作用

心肌梗死(簡稱心梗)往往繼發(fā)于嚴重的冠脈硬化。及時有效的血運重建可有效地挽救心肌，減少心梗面積，改善患者轉歸。然而，血運重建后I/R損傷仍帶來不可避免的危害。

研究證明心梗引發(fā)無菌性炎癥反應［9］。以下現(xiàn)象支持NLRP3參與該過程:ASC缺陷的小鼠心梗后，心肌組織中浸潤的巨噬細胞以及中性粒細胞表達ASC及半胱天冬酶-1明顯升高［10］，同時NLRP3可識別心肌損傷后釋放的多種DAMPs;在肝臟I/R過程中，NLRP3促進炎癥因子釋放并造成后續(xù)I/R損傷;NLRP3表達缺陷的小鼠模型中，I/R損傷明顯下降［11］。但目前尚不能確定NLRP3介導此炎癥反應。Kawaguchi等［12］研究表明，心梗發(fā)生早期，心肌成纖維細胞可能起到始動炎癥的作用。Masafumi提出以下假說:由于血供明顯不足或中斷，心肌細胞受損后釋放DAMPs，心肌成纖維細胞膜上的 Toll樣受體識別DAMPs后促進胞內NF-κB和NLRP3表達;受損的心肌成纖維細胞發(fā)生ATP依賴的K+外流以及再灌注過程中大量產生的ROS，進一步激活成纖維心肌細胞中的NLRP3。通過刺激IL-1β釋放而募集骨髓起源巨噬細胞及中性粒細胞［11］;而骨髓起源的白細胞可識別DAMPs后活化胞內NLRP3，放大炎癥反應［13］。

1.3 NLRP3在心肌纖維化中的作用以及對心功能的影響

低氧或I/R損傷時，心肌成纖維細胞作為“前哨細胞”識別DAMPs后激活炎癥小體，促進IL-1β及IL-18釋放［12］。IL-1β 升高后，腫瘤壞死因子 α(TNF-α蘆)和白介素6(IL-6)水平隨之升高，隨后，轉化生長因子β1(TGF-β1)和血小板衍生生長因子(PDGF)水平升高，誘導膠原沉積;TGF-β1和IL-1β各自可保持信號環(huán)路以自分泌形式促進自身表達;二者之間存在協(xié)同作用并共同促進細胞外膠原的硬化，膠原硬化促進細胞間質中其他膠原分泌和(或)TGF-β1的釋放;IL-1受體拮抗劑可明顯降低傷口處的纖維化程度［14］。IL-18與1、3型膠原表達呈劑量依賴關系［15］。重組IL-18可誘導心臟重構以及心肌間質纖維化［16］;IL-18亦可誘導成纖維細胞增生和α2β1整合蛋白表達。后者為膠原綁定的主要受體［15］。心梗后患者體內IL-18明顯升高往往提示預后不佳。

然而，炎癥小體引起纖維化只是偶然現(xiàn)象，這可能是因為纖維化要在特定條件下才可發(fā)生，如:活化炎癥小體的種類、基因突變影響自分泌或旁分泌的信號途徑、多種炎癥小體的相互作用抑或是上述多種因素的共同作用等。詳細的機制仍需要進一步明確。

NLRP3可促進心梗后的心臟負性重構:Cryopyrin屬于NOD家族，可識別DAMPs后激活NLRP3;沉默NLRP3的信使RNA或使用Cryopyrin抑制劑可顯著減少心梗面積，抑制心室腔的擴大，但并不抑制心臟合理的代償性重構［17］。IL-1β在缺血性心肌病中起著重要作用:IL-1β可導致鈣瞬變受損、心臟纖維化及重構，進而誘導心衰病人的心臟收縮功能和活動耐量下降［18］。IL-1受體拮抗劑可減少心臟重構，改善心功能及中和血清炎性標志物［19］。即使在非心梗模型中，NLRP3同樣被證明可以通過IL-1β促進心功能下降［18］。

單純心肌組織的細胞丟失及纖維化并不足以影響心功能［20］:心臟特異性磷酸酶過度表達的小鼠有炎性和結構性心衰的表現(xiàn)，包括心肌肥厚、局部缺血以及收縮、舒張功能的下降?？梢圆孪氲?，炎癥對心功能的影響遠不止細胞凋亡和間質纖維化。然而無法解釋炎癥小體活化、促炎癥因子與心臟收縮性、鈣穩(wěn)態(tài)以及興奮偶聯(lián)機制之間的關系。

近來研究表明，由于人類心肌缺血組織細胞中NLRP3基因Q705 A位點突變，使得該區(qū)域NLRP3的表達低于非缺血部位［21］。Q705 A突變可引起IL-1β和IL-18水平升高進而造成NLRP3表達降低，促使免疫反應缺陷而引起的炎癥反應增強。

2 抗炎癥治療策略

NLRP3介導的炎癥反應參與冠脈硬化、心梗、I/R損傷以及心梗后心臟重構的過程。調控炎癥反應水平，對預防、治療疾病及改善預后極有意義。

NLRP3主要被ROS、K+外流或細胞外ATP濃度升高所激活?？寡趸镆种芌OS產生，減少半胱天冬酶-1產生以及IL-1β的釋放［22］?？寡趸镆延糜谂R床治療，但其存在局限性:抗氧化物缺乏特異性，針對局部炎癥的同時抑制其他部位生理的炎癥反應。受損細胞及凋亡細胞附近往往存在高濃度的 ATP［23］。P2X7受體被高濃度ATP活化后激活NLRP3，而P2X7受體拮抗劑可抑制炎癥小體活化并下調IL-1β水平。多個臨床試驗正在驗證P2X7受體拮抗劑治療慢性炎性疾病的有效性［24］。范連素(pannexin-1)參加NLRP3的活化，或作為ATP釋放的通道，或作為P2X7受體下游分子信號。丙磺舒(probenecid)可能會抑制范連素，降低炎癥水平。但實驗證明敲除范連素基因的小鼠亦可激活NLRP3［25］。所以，范連素在NLRP3活化中的作用以及丙磺舒的作用機制仍需進一步研究。雖然需進一步證明胞內K+濃度的下降對激活NLRP3是否足夠或者必要，但抑制K+-ATP通路可能起到控制NLRP3活性的作用。早在1997年，就有關于格列苯脲阻斷胰島β細胞的K+-ATP通道，減輕胰腺炎癥反應，保護胰腺功能的報道。格列苯脲可能通過阻斷NLRP3活化發(fā)揮作用，但其藥理機制復雜，有待進一步證明。

IL-1β和IL-18為NLRP3下游效應因子。目前，抗IL-1β藥物主要分為3類:(1)IL-1受體拮抗劑，如阿那白滯素(anakinra)，其與IL-1競爭結合IL-1受體，不引起后續(xù)反應;(2)抗IL-1β抗體，如康納單抗(canakinumab)，其選擇性地與IL-1β結合，并使其失活;(3)IL-1誘捕劑，如利納西普(rilonacept)。在人類IgG上融合兩部分結構:IL-1受體與IL-1受體拮抗劑。IL-1與IL-1受體結合后因IL-1受體拮抗劑的作用而不引發(fā)后續(xù)反應［26］。3種藥物的臨床有效性均得到證實。此外，Xoma 52為選擇性更高的IL-1β抗體。該藥正在進行2型糖尿病和心血管疾病的臨床試驗［27］。抑制半胱天冬酶-1的藥物如ritonovir可以降低活化IL-18水平;如VX-765降低冷吡啉相關周期性綜合征(cryopyin-associated periodic syndrome，CAPS)患者 IL-1β和IL-18水平，但有效性不如阿那白滯素［27］。

炎癥小體始動炎癥反應。抑制NLRP3亦可調控炎癥反應。但NLRP3可被多種信號系統(tǒng)所激活;各個系統(tǒng)詳細的分子機制仍不明確。所以針對NLRP3藥物的開發(fā)尚處于起始階段。目前策略為抑制NOD部位的重構或 NLR分子的 ATP酶活性［28］和抑制 ASC活性［29］。此外，近來報道促進炎癥小體活化也可起到控制炎癥的作用［30］。這可能與前文中提到的缺血心肌組織處因基因突變致使NLRP3表達下降造成免疫缺陷有關［21］。

3 展 望

心血管疾病的治療基于合理的炎癥控制。獲取最佳的抗炎癥治療效果可從以下幾方面入手:首先，可以建立良好的檢測方法獲得NLRs分子中ATP酶活性，探討心肌組織的NLRP3是否具有組織特異性，采取有針對性的治療措施。其次，進一步明確配體與受體結合后的下游信號機制:除了IL-1β和IL-18外，NLRP3依然可激活其他細胞因子和炎癥因子;體內尚存在許多抑制NLRP3的因素，如下調TLRs的信號、機體釋放的自身IL-1受體拮抗劑等。IL-1受體拮抗劑/IL-1β比IL-1β可更好地預測疾病的發(fā)展。上述問題的解決可以有助于制定更有效、選擇性更高、調控作用更好、副作用更少的治療策略。目前，最有希望治療慢性炎癥的藥物為抗IL-1β藥物、半胱天冬酶-1抑制劑以及P2X7受體拮抗劑。這幾類藥物的藥物代謝動力學特性、生物利用度、劑型和使用方法的基礎與臨床相結合的研究將有助于推廣使用這些藥物。

心梗以及心梗后修復的過程中，炎癥反應起雙向作用:早期炎癥反應清除壞死組織，促進肉芽組織形成，限制缺血對心梗周圍組織的損傷，穩(wěn)定細胞外基質，促進瘢痕形成;然而，炎癥反應過度可引起心梗周圍區(qū)域組織損傷，擴大心梗面積，增強心肌纖維化，促進心室重構，降低心功能，甚至導致急性期心臟破裂。所以，實施抗炎治療時，必須考慮如下問題:如何確定使用抗炎癥藥物的時機?如何確定心梗后炎癥的程度?如何確定心梗后使用抗炎癥藥物的持續(xù)時間?如何確定抗炎癥藥物恰當?shù)膽贸潭?發(fā)現(xiàn)新的反映炎癥程度特異性較高血清標記物對解決上述問題起到關鍵作用。此外，對于存在冠心病高危因素但尚未發(fā)生明顯冠脈硬化的患者，是否需要早期使用抗炎癥藥物?開發(fā)更多的檢測手段以及進行設計精良的臨床試驗將有助于進一步解決上述問題。

4 小 結

NLRP3在冠脈硬化、心梗、I/R損傷以及心臟重構過程中起到重要作用。針對NLRP3的激活方式、作用方式以及本身可開發(fā)出諸多治療策略。目前最有希望的治療為抗IL-1、抑制半胱天冬酶-1以及拮抗P2X7受體。進一步研究NLRP3激活機制，設計更加精良的動物實驗，采用臨床試驗進一步研究抗炎癥藥物的使用時機、程度以及藥代動力學特點，可促進抗炎癥治療的臨床推廣應用。

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