吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯及凋亡的影響

趙綠翠，張景勍，游智梅，李科瓊，羅 念，李 靜

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室干細(xì)胞與組織工程實(shí)驗(yàn)室，2.藥物高校工程研究中心，重慶 400016)

吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯及凋亡的影響

趙綠翠2，張景勍2，游智梅1，李科瓊1，羅 念1，李 靜1

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室干細(xì)胞與組織工程實(shí)驗(yàn)室，2.藥物高校工程研究中心，重慶 400016)

目的 探討吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯及凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞分別加入?yún)擒镙菈A1.5,3.0,6.0和12 μmol·L－1繼續(xù)培養(yǎng)24,48和72 h,CCK-8法檢測吳茱萸堿對(duì)HCT-116細(xì)胞存活的影響；用流式細(xì)胞術(shù)檢測吳茱萸堿對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響；倒置顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；熒光顯微鏡觀察 Hoechst染色后細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；Western蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞周期蛋白A1的表達(dá)及凋亡相關(guān)蛋白P53,Bax,Bcl-2,激活型胱天蛋白酶3的表達(dá)。結(jié)果 吳茱萸堿1.5,3.0和6.0 μmol·L－1作用24,48和72 h后,HCT-116細(xì)胞增殖受到抑制(P＜0.05),且呈時(shí)間(r時(shí)間＝0.744,P＜0.05)和濃度(r濃度＝0.953,P＜0.01)依賴性。吳茱萸堿作用HCT-116細(xì)胞48 h后,S期細(xì)胞由正常對(duì)照組的(13.9±7.0)%增加至(39.7±11.7)%(P＜0.05)；細(xì)胞凋亡率由正常對(duì)照組的(4.2±3.0)%增加至(14.9±5.8)%(P＜0.05)。光學(xué)顯微鏡下可見,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變,胞膜破裂,產(chǎn)生細(xì)胞碎片,并出現(xiàn)大量漂浮細(xì)胞；Hoechst染色可見部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、核發(fā)白、染色質(zhì)凝集等凋亡變化；P53、Bax和激活型胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)增加,Bcl-2、細(xì)胞周期蛋白A1蛋白表達(dá)下降。結(jié)論 吳茱萸堿能夠通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白A1的表達(dá)；激活P53信號(hào)通路,下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax,破壞Bcl-2/Bax的比例；激活胱天蛋白酶3,共同促進(jìn)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的凋亡。

吳茱萸堿；HCT-116細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；細(xì)胞周期蛋白A1；胱天蛋白酶3

人結(jié)腸癌是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，其發(fā)病率居全球常見惡性腫瘤的第3位，每年新增患者＞100萬人，其死亡率＞30%[1－2]。對(duì)于早期患者，臨床治療主要以手術(shù)為主，但對(duì)于晚期和復(fù)發(fā)患者，大多只能依靠放療或化療的方式進(jìn)行治療。結(jié)腸癌化療一般采用聯(lián)合化療，利用不同的化療藥，對(duì)腫瘤細(xì)胞的打擊面增寬，可以減少耐藥的發(fā)生。但是化療藥物本身存在極大的毒副作用，導(dǎo)致患者因承受不了化療的痛苦而放棄治療甚至因化療致死。因而，尋找低毒高效的抗結(jié)腸癌中藥，提高患者的生活質(zhì)量成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸〔Evodia rutaecarpa (Juss.)Benth.〕，石虎〔E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Dode)Huang〕或梳毛吳茱萸〔Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.Var.bodinieri (Dode)Huang〕的干燥近成熟果實(shí)。主產(chǎn)于長江流域、陜西及華南等地。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛、苦，性熱；具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉之功。常用于治療肝胃虛寒、陰濁上逆所致的頭痛或胃脘疼痛等癥。吳茱萸堿(evodiamine)是其有效成分。近年來的研究表明，吳茱萸堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞，如人宮頸癌HeLa細(xì)胞[3]、人前列腺癌pc-3細(xì)胞[4]、人肝癌HepG2細(xì)胞[5]、人急性白血病CCRFCEM細(xì)胞[6]和小鼠纖維肉瘤L929細(xì)胞[7]、人胃癌SGC-7901細(xì)胞[8]及人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞[9]等具有明顯的抑制作用，但未見其對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞作用與機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本文以人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116為研究對(duì)象，觀察吳茱萸堿對(duì)細(xì)胞存活和凋亡的影響，并初步探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品購自中國南京澤朗醫(yī)藥公司，批號(hào)為ZL20131015，HPLC檢測純度≥98%，規(guī)格為50 mg/支。用二甲亞砜(DMSO)溶解，儲(chǔ)存濃度為100 μmol·L－1，實(shí)驗(yàn)時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度(DMSO終體積分?jǐn)?shù)不超過0.001)。高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所；AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、Hoechst染色試劑盒、兔抗人胱天蛋白酶3單克隆抗體均購自碧云天生物技術(shù)研究所；P53、Bax、Bcl-2抗體購于美國Abcam公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白A1多克隆抗體購于美國Immunoway公司；β肌動(dòng)蛋白抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購于美國Cell Signaling Technology公司；ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；超低溫冰箱，美國Revco公司；高速臺(tái)式離心機(jī)，美國Sigma公司；倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；純水儀，美國Millipore公司；FACScan流式細(xì)胞儀，美國 Becton Dickinson公司；M450酶標(biāo)儀，PAC3000型電泳儀、電轉(zhuǎn)儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng)

人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部遺傳教研室惠贈(zèng)。用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活抑制率

取處于對(duì)數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108L－1，以每孔100 μL的細(xì)胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)過夜貼壁后棄去培養(yǎng)上清液，加入?yún)擒镙菈A，使其終濃度為1.5，3.0，6.0和12.0 μmol·L－1，每孔200 μL，每個(gè)藥物組作3個(gè)復(fù)孔，各藥物作用組作為實(shí)驗(yàn)組。空白組為含0.1% DMSO的200 μL完全培養(yǎng)基，對(duì)照組為含與實(shí)驗(yàn)組等量細(xì)胞的200 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)24，48和72 h后，每孔加入20 μL的CCK-8試劑并放孵箱孵育3 h，酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定各孔的吸光度(A450nm值)，細(xì)胞存活抑制率由下面公式計(jì)算:

細(xì)胞存活抑制率%＝〔1－(實(shí)驗(yàn) A－空白A)/ (對(duì)照A－空白A)〕×100%

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長期的人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，以2×108L－1的密度接種于6孔板，分別設(shè)置對(duì)照組和藥物組，每組平行3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后藥物組加入終濃度為1.5，3.0和6.0 μmol·L－1的吳茱萸堿處理48 h，棄上清并以PBS液洗滌1次，收集細(xì)胞，70%冰乙醇重懸，4℃固定過夜。離心后棄去固定液，用適量PBS重懸，加入RNA酶工作液和碘化丙啶，4℃避光染色30 min，過濾網(wǎng)后，進(jìn)行常規(guī)光路校準(zhǔn)，流式細(xì)胞儀檢測，經(jīng)計(jì)算軟件分析得到細(xì)胞周期各時(shí)相比例。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長期的人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，以2×108L－1的密度接種于6孔板，分別設(shè)置對(duì)照組和藥物組，每組平行3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后藥物組分別加入終濃度為1.5，3.0和6.0 μmol·L－1的吳茱萸堿處理48 h，收集上清并以PBS液洗滌1次，收集全細(xì)胞，按照AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞檢測試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.6 Hoechst染色檢測細(xì)胞核的形態(tài)變化

取無菌的防脫蓋玻片置于6孔板內(nèi)，以2×108L－1的密度接種于6孔板。分別設(shè)置對(duì)照組和藥物組，每組平行3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后藥物組加入終濃度為1.5，3.0和 6.0 μmol·L－1的吳茱萸堿處理48 h，吸盡舊培養(yǎng)液，每孔加入1 mL固定液，固定30 min。去除固定液，用PBS洗2次，每次3 min。吸盡液體，加入1 mL Hoechst33258染色液，染色5 min。棄去染色液，用PBS洗2遍，每次3 min。滴1～2滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞面接觸封片液，盡量避免氣泡產(chǎn)生。使用熒光顯微鏡觀察，激發(fā)波長為350 nm左右，發(fā)射波長460 nm左右。隨機(jī)選取3個(gè)視野，觀察細(xì)胞核染色并拍照。

1.7 倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

取對(duì)數(shù)生長期的人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，以2×108L－1的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后棄去上清，分別加入含終濃度為1.5，3.0和6.0 μmol·L－1的吳茱萸堿的完全培養(yǎng)基作用48 h，光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取≥3個(gè)視野進(jìn)行拍照。

1.8 Western蛋白質(zhì)印跡檢測細(xì)胞周期蛋白A1、P53、Bax、BcI-2和激活型胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)

取處于對(duì)數(shù)生長期的人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞以5×108L－1的密度接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，分別設(shè)置對(duì)照組和藥物組，常規(guī)培養(yǎng)24 h后藥物組分別加入終濃度為1.5，3.0和6.0 μmol·L－1的吳茱萸堿誘導(dǎo)48 h，用細(xì)胞裂解液于冰上同時(shí)裂解各組細(xì)胞30 min，16 000×g，離心10 min，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。運(yùn)用酶標(biāo)儀測定各組蛋白質(zhì)含量并配平，使各組蛋白終濃度一致。每個(gè)點(diǎn)樣孔加樣40 μg蛋白樣品液，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到0.45 μm的PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉膜上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)2 h。采用兔抗人細(xì)胞周期蛋白A1(1∶500)、P53 (1∶1000)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、激活型胱天蛋白酶3(1∶1000)，兔抗人內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白多抗(1∶1000)，4℃孵育過夜。用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。分別加入辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1000)常溫孵育1.5 h。TBST溶液漂洗，用ECL試劑發(fā)光，曝光。圖像掃描后運(yùn)用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的吸光度值，將對(duì)照組和藥物組的目的條帶的積分吸光度值和內(nèi)參的積分吸光度值比值表示蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞存活抑制率的影響

CCK-8結(jié)果(圖1)顯示，吳茱萸堿1.5，3.0，6.0和12.0 μmol·L－1分別作用HCT-116細(xì)胞48 h后，HCT-116細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用，且隨著吳茱萸堿濃度的增加和作用時(shí)間的延長，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈時(shí)間和濃度依賴性。與正常對(duì)照組相比，吳茱萸堿1.5，3.0，6.0和12.0 μmol·L－1對(duì)HCT-116細(xì)胞存活抑制率顯著增加，分別為(0.21±0.06)%，(0.27±0.03)%，(0.51±0.02)%和(0.58±0.02)%(P＜0.01)。此外，吳茱萸堿12 μmol·L－1表現(xiàn)出一定程度的細(xì)胞毒性。吳茱萸堿與HCT-116細(xì)胞作用24，48和72 h的IC50值分別為8.24±0.72，7.50±0.47和(5.13±1.10)μmol·L－1。

Fig.1 Effect of evodiamine on proIiferation of HCT-116 ceIIs.n＝3.

2.2 吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(圖2，表1)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，吳茱萸堿1.5，3.0和6.0 μmol·L－1誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞48 h后，各時(shí)相的細(xì)胞比例發(fā)生了不同程度的變化。藥物組的G0/G1期的細(xì)胞比例由正常對(duì)照組的(77.4±5.7)%下降至(18.4±8.3)%(P＜0.01)；S期的細(xì)胞比例由正常對(duì)照組的(13.9±7.0)%增加至(39.7±11.7)%(P＜0.05)；G2/M期的細(xì)胞比例由正常對(duì)照組的(10.0±1.3)%增加至(41.9±19.8)%(P＜0.01)，細(xì)胞周期被阻滯在S期和G2/M。

Tab.1 Effect of evodiamine on ceII cycIe of HCT-116 ceIIs

2.3 吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 流式儀檢測

吳茱萸堿1.5，3.0和6.0 μmol·L－1作用HCT-116細(xì)胞 48 h后，HCT-116細(xì)胞的凋亡率分別為(7.3±1.2)%，(13.0±4.0)%和(14.9±5.8)%，隨著藥物濃度的增加，HCT-116細(xì)胞的凋亡率逐漸增高，與正常對(duì)照組的(4.2±3.0)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Fig.3 Effect of evodiamine on apoptosis of HCT-116 ceIIs detected by fIow cytometry.A:normal control；B－D: evodiamine 1.5，3.0 and 6.0 μmol·L－1for 48 h，respectively.

2.3.2 Hoechst染色

圖4結(jié)果顯示，正常對(duì)照組的HCT-116細(xì)胞發(fā)出均勻的淡藍(lán)色熒光，細(xì)胞核無明顯的凋亡形態(tài)學(xué)變化(圖4A)；吳茱萸堿1.5，3.0和6.0 μmol·L－1分別作用48 h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的核染色質(zhì)濃縮聚集，核碎裂，核邊集，并發(fā)出較強(qiáng)的藍(lán)白色熒光，表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的典型病理變化(圖4B～D)。

Fig.4 Effect of evodiamine on morphoIogy of HCT-116 ceII nucIeus.A:normal control of HCT-116 cells；B－D:evodiamine 1.5，3.0 and 6.0 μmol·L－1for 48 h，respectively.Arrows show pathologic changes in apoptosis.

2.4 吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖5，正常對(duì)照組細(xì)胞生長良好，細(xì)胞輪廓清晰規(guī)則，呈多邊形，細(xì)胞間相互邊接成片生長(圖5A)；吳茱萸堿1.5，3.0和6.0 μmol·L－1分別作用HCT-116細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞數(shù)目顯著減少，細(xì)胞皺縮變圓變小(圖5B～D)，碎裂，細(xì)胞畸形，出現(xiàn)大量漂浮細(xì)胞。

Fig.5 Effect of evodiamine on morphoIogy of HCT-116 ceIIs by opticaI microscopy.A:normal control；B－D:evodiamine 1.5，3.0 and 6.0 μmol·L－1for 48 h，respectively.Arrows show morphological changes in apoptosis.

2.5 吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞周期蛋白A1、P53信號(hào)通路及激活型胱天蛋白酶3蛋白的影響

Western印跡檢測結(jié)果顯示，吳茱萸堿1.5，3.0和6.0 μmol·L－1分別作用于HCT-116細(xì)胞48 h后，與正常對(duì)照組比較(圖6)，P53抑癌蛋白、凋亡促進(jìn)蛋白Bax和激活型胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)上調(diào)；凋亡抑制蛋白Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白A1的表達(dá)下調(diào)，與正常對(duì)照組之間的對(duì)比均有顯著性差異(P＜0.05)。這一結(jié)果表明，在吳茱萸堿誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡的過程中，可能存在細(xì)胞周期蛋白A1的下調(diào)、P53信號(hào)和胱天蛋白酶3激活的共同參與。

Fig.6 Effect of evodiamine on cycIinA1(B)，P53(C)，Bax(D)，BcI-2(E)，cIeaved caspase-3(F)protein expression of HCT-116 ceIIs detected by Western bIotting.B－F were the semiquantitative results of A.Lane 1: normal control；lanes 2－4:evodiamine 1.5，3.0 and 6.0 μmo·lL－1for 48 h，respectivelyn＝3.?P＜0.05，??P＜0.01，compared with evodiamine 0 μmol·L－1group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞也有較強(qiáng)的殺傷作用，能有效抑制HCT-116細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，吳茱萸堿對(duì)HCT-116細(xì)胞周期的分布有顯著的影響，可使HCT-116細(xì)胞周期阻滯在S期和G2/M期，從而影響細(xì)胞周期的正常運(yùn)行。細(xì)胞周期蛋白A1是細(xì)胞周期的一種正性調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞S期和G2/M期的周期調(diào)節(jié)，是人類細(xì)胞周期蛋白家族中的一個(gè)主要成員。細(xì)胞周期蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可與癌基因產(chǎn)物協(xié)同產(chǎn)生抗癌作用。周期蛋白A1在細(xì)胞周期進(jìn)程中，分別與CDK1和CDK2結(jié)合，以復(fù)合物的形式作用于2個(gè)檢查點(diǎn)G1/S期和G2/M期的轉(zhuǎn)換，具有調(diào)節(jié)DNA合成和促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的雙重作用。有關(guān)研究報(bào)道，細(xì)胞周期蛋白A1參與P53信號(hào)通路激活所致的細(xì)胞凋亡和增殖阻滯作用[10]。

Western印跡檢測結(jié)果顯示，吳茱萸堿引起細(xì)胞周期阻滯時(shí)伴隨著細(xì)胞周期蛋白A1的下調(diào)。提示吳茱萸堿可能通過抑制HCT-116細(xì)胞周期蛋白A1蛋白的表達(dá)引起細(xì)胞的S期和G2/M期阻滯進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。

Hoechst染色發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿能使HCT-116細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮聚集，核碎裂，并發(fā)出較強(qiáng)的藍(lán)白色熒光等細(xì)胞凋亡特征。且AnnexinⅤ/PI雙染色法檢測結(jié)果也證實(shí)，隨著藥物濃度的增加，HCT-116細(xì)胞的凋亡率逐漸增高。綜上，吳茱萸堿可誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡，阻止腫瘤惡化。

p53(mtp53)基因是一種抑癌基因，是迄今為止與人類惡性腫瘤相關(guān)性最高的腫瘤抑制基因，該基因位于人第17對(duì)染色體的短臂上[11]，P53信號(hào)通路為癌癥發(fā)生中的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路。p53基因可以通過參與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和DNA的修復(fù)等，發(fā)揮避免受損DNA堆積、維持基因組的穩(wěn)定及調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化與衰老等功能活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，許多天然抗腫瘤藥物可以通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)p53基因的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[12－14]。本研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)伴隨著P53蛋白的上調(diào)。吳茱萸堿可能通過激活P53通路來啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑，從而引起凋亡的發(fā)生。另外，P53信號(hào)通路中的Bcl-2和Bax間的比例決定該細(xì)胞是否接受凋亡發(fā)生的信號(hào)[15]。Bcl-2家族成員與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Bcl-2蛋白在一些腫瘤細(xì)胞如白血病中呈過度表達(dá)；其在細(xì)胞中的定位已經(jīng)證實(shí)，在不同類型的細(xì)胞中可以定位于核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體上，并通過阻止線粒體細(xì)胞色素c的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用；Bax是Bcl-2家族中參與細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要成員，當(dāng)細(xì)胞受到外界干擾或刺激而發(fā)生凋亡時(shí)，它從胞質(zhì)遷移至線粒體和核膜，導(dǎo)致包括細(xì)胞色素c在內(nèi)的多種促凋亡蛋白的釋放，并激活胱天蛋白酶家族，產(chǎn)生胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)執(zhí)行細(xì)胞凋亡；而胱天蛋白酶3是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一，可以剪切細(xì)胞凋亡過程中的許多關(guān)鍵蛋白。Western印跡檢測結(jié)果顯示，吳茱萸堿能有效抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，即Bcl-2和Bax間的比例被破壞，同時(shí)激活胱天蛋白酶3，共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡有可能通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白A1的表達(dá)，同時(shí)激活P53信號(hào)通路和胱天蛋白酶3共同實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞有明顯的抗癌活性，且起效濃度低，因而為臨床腫瘤的治療開發(fā)一種低毒高效的抗腫瘤藥物或藥物前體提供了一定的參考價(jià)值，是一種開發(fā)前景廣闊的天然藥物。但關(guān)于吳茱萸堿具體作用位點(diǎn)和詳細(xì)作用機(jī)制，以及其毒性作用以及藥動(dòng)學(xué)特性等均不明確，還有待進(jìn)一步的研究。

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Effect of evodiamine on apoptosis and ceII cycIe arrest in human coIorectaI cancer ceIIs

ZHAO Lyu-cui2，ZHANG Jing-qing2，YOU Zhi-mei1，LI Ke-qiong1，LUO Nian1，LI Jing1
(1.Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering，Department of History and Embryology，Chongqing Medical University，2.Drug Engineering Research Center of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

OBJECTIVE To investigate the effect of evodiamine on proliferation of human colorectal cancer cells and to explore its mechanism of apoptosis in human colorectal cancer cells.METHODS Human colorectal cancer cell lines(HCT-116)were cultured with evodiamine at the concentrations of 1.5，3.0 and 6.0 μmol·L－1for 24，48 and 72 h，respectively.The proliferation of cells was detected by CCK-8，the cell cycle and apoptosis of cells treated were measured by flow cytometry，changes in cell morphology were observed under an inverted microscope and morphological changes in apoptotic cells were observed under a fluorescence microscope after Hoehst staining.The protein expression of P53，Bax，Bcl-2，cleaved caspase 3 and cyclin A1 was examined by Western blot.RESULTS The proliferation of cells was significantly inhibited by evodiamine in a time and concentration-dependent manner(rTime＝0.744，P＝0.05；rConcentration＝0.953，P＜0.01).The percentage of cells in S phase increased from(13.9± 7.0)%to(39.7±11.7)%(P＜0.05)and the rate of apoptosis cells up-regulated from(4.2±3.0)%to (14.9±5.8)%(P＜0.05)when HCT-116 cells were treated with different concentrations of evodiamine for 48 h.Plasmatorrhexis and distortion occurred in a concentration-dependent manner while a large amount of cell debris and a large number of floating cells were observed under the microscope.Hoechst staining indicated cell shinkage，nuclear condensation and appare pale.The expression of P53，Bax and cleaved caspase 3 was obviously increased while the Bcl-2 and cyclin A1 significantly decreased.CONCLUSION Evodiamine can induce the apoptosis of human colorectal cancer cells mainly by down-regulating the expression of cyclin A1 and activation of P53 signal pathway，breaking the balance of Bcl-2/Bax，and ultimately activating caspase 3.

evodiamine；HCT-116 cells；apoptosis；cell cycle；cyclin A1；caspase 3

LI Jing，Tel:13370762980，E-mail:lijingyangyang＠126.com

R285，R966

:A

:1000-3002(2014)06-0863-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.008

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(31271368)；and by Chongqing Municipal Education Commission Foundation Project(KJ130312)

2014-06-24 接受日期:2014-09-30)

(本文編輯:喬 虹)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271368)；重慶市教委基金項(xiàng)目(KJ130312)

趙綠翠，女，碩士研究生，主要從事中藥及其有效成分抗腫瘤分子細(xì)胞藥理學(xué)的研究。

李 靜，E-mail:lijingyangyang＠126.com，Tel:13370762980