貝伐珠單抗對HaCaT細胞凋亡及周期的影響

吳 倩魏志平劉彥群陳丹萍

貝伐珠單抗對HaCaT細胞凋亡及周期的影響

吳 倩1魏志平2?劉彥群2陳丹萍3

目的: 評價貝伐珠單抗對HaCaT細胞凋亡的影響。方法: 體外培養(yǎng)HaCaT細胞，不同濃度貝伐珠單抗分別作用HaCaT細胞48 h后，Hoechst 33258熒光染色法觀察貝伐珠單抗誘導HaCaT細胞凋亡的形態(tài)學變化；流式細胞術(shù)檢測貝伐珠單抗HaCaT細胞凋亡及細胞周期的影響。結(jié)果: 貝伐珠單抗處理HaCaT細胞48 h后，Hoechst 33258熒光染色顯示細胞核染色質(zhì)凝聚、邊集、核裂解；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示細胞凋亡增加，G0/G1期細胞的比例增加。結(jié)論: 貝伐珠單抗可誘導HaCaT細胞凋亡，同時可有效阻滯HaCaT細胞的周期進程，細胞周期被阻滯在G0/G1期。

HaCaT細胞； 貝伐珠單抗； 凋亡； 細胞周期

貝伐珠單抗(Bevacizumab)又叫安維汀(Avastin)、阿瓦斯丁，是重組的人源化IgG1單克隆抗體，靶向作用于腫瘤賴以生存的血管，通過抑制腫瘤血管生成，達到阻止腫瘤生長的目的。體內(nèi)、外研究證實貝伐珠單抗能與VEGF結(jié)合，阻止其與內(nèi)皮細胞表面受體結(jié)合，從而阻斷其生物活性發(fā)揮抗血管增生作用。貝伐珠單抗目前在臨床上已經(jīng)應(yīng)用于以聯(lián)合5－氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療方案，一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌。在一些以血管增生為基礎(chǔ)的疾病，如視網(wǎng)膜血管增生等疾病的治療中也進行了臨床研究并取得良好效果。1近年的研究表明靶向作用于銀屑病病理性血管生成可明顯改善銀屑病免疫學和表皮的變化，且在臨床治療中也觀察到應(yīng)用貝伐珠單抗治療癌癥的同時患者的銀屑病癥狀可得到明顯改善。2但貝伐珠單抗對角質(zhì)形成細胞的生物學作用及其機制尚未闡明。本實驗以HaCaT細胞為角質(zhì)形成細胞模型，研究貝伐珠單抗對HaCaT細胞凋亡及其周期的影響，為其治療銀屑病提供實驗和理論依據(jù)，試圖為銀屑病的臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細胞與試驗藥物 人永生化角質(zhì)形成細胞株(HaCaT細胞)購于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。貝伐珠單抗，規(guī)格100 mg/4 m L，購于Roche公司。

1.2 試劑 RPMI 1640購于美國Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；Hoechst 33258染色液購于Beyotime公司；Annexin V－FITC凋亡檢測試劑盒購于北京寶賽生物技術(shù)有限公司；細胞周期PI染液購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 HaCaT細胞培養(yǎng)及實驗分組 HaCaT細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗選用對數(shù)生長期細胞。HaCaT細胞分組處理如下:I組:對照組，只加RPMI 1640培養(yǎng)液；II組:50μg/mL貝伐珠單抗組；III組:100μg/m L貝伐珠單抗組；IV組:200 μg/mL貝伐珠單抗組；V組:400μg/mL貝伐珠單抗組；貝伐珠單抗用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.4 方法

1.4.1 Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡 (1)配制Hoechst 33258工作液取試劑盒中Hoechst 33258原液用蒸餾水稀釋10倍，即得Hoechst 33258工作液。(2)調(diào)整HaCaT細胞濃度為1×104/mL，以每孔1 mL接種于24孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后加入不同濃度貝伐珠單抗，分組同上，培養(yǎng)48 h后小心吸除上清，用預冷的PBS溶液洗滌細胞兩次。(3)加入1 mL的4%甲醛溶液，4℃固定細胞10 min。(4)用預冷的PBS溶液洗滌2次，爬片水紙吸盡周邊的水分。(5)每孔滴加100μL Hoechst 33258工作液，室溫避光染色10 min，PBS溶液沖凈晾干。(6)以340 nm紫外光激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)并拍照。

1.4.2 流式細胞術(shù)檢測貝伐珠單抗對HaCaT細胞凋亡的影響 選用對數(shù)生長期細胞，以1×105/mL接種于6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后更換無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，細胞分組同上，每組設(shè)3個復孔，48 h后收集細胞進行檢測，具體步驟如下:(1)棄培養(yǎng)基，用1×PBS清洗1次；(2)每孔加入1 mL 0.25%胰酶消化5 min；(3)每孔加入1 mL含血清培養(yǎng)基終止胰酶消化，微量移液器吹打細胞使其脫落；(4)細胞計數(shù)，取5×105或1×106個細胞移至離心管，1000 r/ min，4℃離心10 min，棄上清；(5)加入1 mL 4℃預冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮；(6)1000 r/min，4℃離心10 min，棄上清；(7)重復步驟(5)(6)洗滌兩次；(8)將細胞重懸于200μL Binding Buffer并移至流式管中；(9)加入10μL Annexin V－FITC輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min；(10)上機前5 min加入300μL Binding Buffer以及5μLPI；(11)流式細胞儀檢測，分析并儲存凋亡圖。

1.4.3 流式細胞術(shù)檢測貝伐珠單抗對HaCaT細胞周期的影響 選用對數(shù)生長期細胞，以1×105/m L接種于6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后更換無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，細胞分組同上，每組設(shè)3個復孔，48 h后收集細胞進行檢測，具體步驟如下:(1)PBS洗兩次，0.25%胰酶消化；(2)加含血清的培養(yǎng)基終止消化，移液槍吹打細胞使其脫落；(3)將細胞懸液移至離心管內(nèi)離心1000 r/min，5 min，棄上清；(4)輕拍離心管使細胞脫離管壁，加入2 mL預冷的PBS；(5)1000 r/min，離心5 min，棄上清；(6)重復步驟(5)(6)洗滌兩次；(7)輕拍離心管使細胞脫離管壁，加入1 mL預冷PBS，輕輕吹勻；(8)在5個新的離心管內(nèi)加入3 m L－20℃預冷的無水乙醇；(9)將(8)中的細胞懸液高速震蕩下緩慢加入(9)中的離心管中；(10)－20℃冰箱中固定保存，待測；(11)－20℃冰箱取出樣本，1000 r/min，離心5 min，棄上清；(12)輕拍試管使細胞脫離管壁，加入3 mL PBS，水合15 min；(13)1000 r/min，離心5 min，棄上清；(14)輕拍離心管使細胞脫離管壁，加1 mL PI染液，震蕩混勻5～10 s，室溫孵育30 min；(15)流式細胞儀上樣檢測，分析并儲存周期時相圖。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用ˉx±s表示。多個均數(shù)比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)。相關(guān)分析用Pearson相關(guān)分析，相關(guān)性用相關(guān)系數(shù)r表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst 33258熒光染色結(jié)果 見圖1。本實驗研究結(jié)果表明對照組HaCaT細胞的胞核完整，呈圓形或橢圓形，熒光染色較淺且較均勻，未觀察到凋亡的形態(tài)學改變；50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL貝伐珠單抗處理后，HaCaT細胞核染色質(zhì)高度凝聚、固縮，部分核染色質(zhì)邊集，或呈碎塊狀致密染色的凋亡形態(tài)學變化。

2.2 貝伐珠單抗對HaCaT細胞凋亡的影響 見表1、圖2。貝伐珠單抗作用HaCaT細胞48h后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明貝伐珠單抗可誘導HaCaT細胞發(fā)生凋亡，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著貝伐珠單抗?jié)舛鹊脑黾親aCaT細胞凋亡率逐漸增加(r＝0.954，P＜0.05)，其中400μg/mL貝伐珠單抗組誘導細胞凋亡的作用最強。

表1 貝伐珠單抗對HaCaT細胞凋亡的影響

2.3 貝伐珠單抗對HaCaT細胞凋亡的影響 見表2、圖3。貝伐珠單抗作用HaCaT細胞48 h后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明各濃度貝伐珠單抗組G0/G1期的細胞比例不同程度的增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗結(jié)果表明貝伐珠單抗可有效阻滯HaCaT細胞的周期進程，細胞周期被阻滯在G0/ G1期，尤以400μg/mL貝伐珠單抗組作用最強。

圖1 HaCaT細胞凋亡形態(tài)學改變(Hoechst 33258熒光染色，×400)

圖2 不同濃度貝伐珠單抗對HaCaT細胞凋亡的影響

圖3 不同濃度貝伐珠單抗對HaCaT細胞周期變化的影響

3 討論

銀屑病的主要病理學特點是表皮角質(zhì)形成細胞過度增殖、分化異常(角化不全)；表皮與真皮間顯著炎細胞浸潤；真皮乳頭層內(nèi)微血管迂曲、擴張、增生。3角質(zhì)形成細胞是表皮的主要構(gòu)成細胞，數(shù)量占表皮細胞的80%以上。銀屑病患者皮損處角質(zhì)形成細胞抵抗細胞凋亡的能力增強，可能是銀屑病發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素之一。4

貝伐珠單抗目前主要作為抗血管增生藥物用于腫瘤的臨床治療，主要機制是阻滯VEGF與內(nèi)皮細胞受體結(jié)合，抑制內(nèi)皮細胞的增殖從而發(fā)揮抗血管增生作用?，F(xiàn)已證實HaCaT能夠自身分泌VEGF并與細胞表面的VEGF受體結(jié)合從而發(fā)揮其生物學效應(yīng)。5貝伐珠單抗作為抗VEGF的IgG1單克隆抗體，對角質(zhì)形成細胞的生物學作用及其機制尚不清楚。

表2 貝伐珠單抗對HaCaT細胞細胞周期變化的影響

本實驗采用Hoechst33258熒光染色在光學顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態(tài)學變化，結(jié)果顯示貝伐珠單抗作用于HaCaT細胞48 h后細胞開始出現(xiàn)較明顯的凋亡形態(tài)學表現(xiàn)，HaCaT細胞核染色質(zhì)高度凝聚、固縮，部分核染色質(zhì)邊集，或呈碎塊狀致密染色，而對照組無明顯變化。本實驗采用流式細胞術(shù)AnnexinVFITC雙染方法檢測各實驗組HaCaT細胞的凋亡率，結(jié)果表明貝伐珠單抗可以促進角質(zhì)形成細胞的凋亡，且隨著藥物濃度的增加細胞的凋亡率逐漸升高。

凋亡是細胞在生理或病理條件下，一種由基因調(diào)控的主動性自我消亡過程，在不引起有害炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)上清除功能失調(diào)或衰老的細胞。凋亡這種獨特的功能在保持皮膚不斷更新的組織穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵的作用，控制著角質(zhì)形成細胞的增殖和角質(zhì)層的形成。6凋亡的失調(diào)在增殖性疾病如癌癥或銀屑病的發(fā)生、維持和發(fā)展中起到重要作用，4而細胞凋亡的平衡有助于過度增殖的角質(zhì)形成細胞恢復穩(wěn)態(tài)并使表皮結(jié)構(gòu)正?；?。所以抑制角質(zhì)形成細胞增殖、誘導其凋亡的藥物可能具有治療銀屑病的潛力。

本實驗采用流式細胞儀檢測細胞周期，結(jié)果顯示貝伐珠單抗作用細胞48 h后，細胞周期中G0/G1期比例明顯增高，各藥物濃度組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義，說明貝伐珠單抗可影響HaCaT細胞細胞周期，把細胞阻滯在G0/G1期，抑制DNA的合成。

一系列的研究證明VEGF的另一個重要作用就是作為一種促存活因子，可以促進角質(zhì)形成細胞的存活。7，8Zhu等9的研究進一步證實了角質(zhì)形成細胞的存活主要是VEGF通過激活其受體信號來實現(xiàn)的，并且推測受體的激活在促進細胞的存活上起到部分作用。本實驗研究結(jié)果表明貝伐珠單抗可誘導HaCaT細胞凋亡，這與Videira等10研究中發(fā)現(xiàn)的貝伐珠單抗誘導膀胱癌細胞凋亡的結(jié)果相似，我們推測這可能是貝伐珠單抗阻滯VEGF發(fā)揮其生物學活性，使得通過激活受體信號的促細胞存活作用無法實現(xiàn)，從而促進了細胞的凋亡。Videira等10研究中發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗可以阻滯膀胱癌細胞的細胞周期，同時發(fā)現(xiàn)在不同的膀胱癌細胞株中貝伐珠單抗阻滯細胞周期的作用位點有顯著的差異，我們推測貝伐珠單抗對細胞周期的阻滯可因細胞的不同而發(fā)生變化，楊曉紅等11證實貝伐珠單抗可通過抑制內(nèi)源性VEGF生物學作用抑制HaCaT細胞的增殖，結(jié)合前面本實驗所得到的結(jié)果我們推測，貝伐珠單抗抑制細胞的增殖作用也有可能是通過阻滯細胞周期抑制DNA合成實現(xiàn)的。貝伐珠單抗對HaCaT細胞確切的作用機制還有待于進一步研究。

1 Hernan CF.The role of antiangiogenesis therapy:Bevacizumab and beyond.Clin Transl Oncol，2009，11(6):349－355.

2 Akman A，Yilmaz E，Mutlu H，et al.Complete remission of psoriasis following bevacizumab therapy for colon cancer.Clin Exp Dermatol，2009，34(5):202－204.

3 Nestle FO，Kaplan DH，Barker J.Psoriasis.N Engl JMed，2009，361(5):496－509.

4 Kastelan M，Prpic－Massari L，Brajac I.Apoptosis in psoriasis. Acta Dermatovenerol Croat，2009，17(3):182－186.

5Elias PM，Arbiser J，Brown BE，et al.Epidermal vascular endothelial growth factor production is required for permeability barrier homeostasis，dermal angiogenesis and the developmentof epidermal hyperplasia:implications for the pathogenesis of psoriasis.Am JPathol，2008，173(3):689－699.

6 Bowen AR，Hanks AN，Allen SM，et al.Apoptosis regulators and responses in human melanocytic and keratinocytic cells.J Invest Dermatol，2003，120(1):48－55.

7 Byrne AM，Bouchier－Hayes DJ，Harmey JH.Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor (VEGF).JCell Mol Med，2005，9(4):777－794.

8 Sanchez A，Wadhawani S，Grammas P.Multiple neurotrophic effects of VEGF on cultured neurons.Neuropeptides，2010，44: 323－331.

9 Zhu JW，Wu WJ，Luo D，etal.Activation of VEGFR－2 signaling in response tomoderate dose of ultraviolet B promotes survival of normal human keratinocytes.Int J Biochem Cell Biol，2012，44(1):246－256.

10 Videira PA，Piteira AR，Gabral MG，et al.Effects of bevacizumab on autocrine VEGF stimulation in bladder cancer cell lines.Urol Int，2011，86(1):95－101.

11楊曉紅，滿孝勇，蔡綏勍，等.VEGF在HaCaT細胞中的自分泌作用.浙江大學學報，2009，38(4):338－342.

(收稿:2013－09－05 修回:2013－11－15)

Effect of Bevaiczumab on apoptosis and proliferation of HaCaT cells

WU Qian，WEIZhi-ping，LIU Yan-qun，et al.Xuzhou Children'sHospital，Xuzhou，221006

Objective:To investigate the effects of Bevacizumab on apoptosis of HaCaT cells.Methods: HaCaT cells were cultured and treated with Bevacizumab in different concentration(50μg/m l、100μg/m l、200μg/m l、400μg/m l).Themorphological change of HaCaT cells was tested by Hoechst 33258 fluorescent staining.The effects of Bevacizumab on apoptosis of HaCaT cells were detected by flow cytometry.Results: After treated with Bevacizumab for 48 h，the HaCaT cells showed typicalmorphological changes of apoptosis such as chromatin condensation，chromatin margination and nuclei fragments.The results of flow cytometry showed an increase in apoptosis of the cells and the ratio of G0/G1 phase cells was also increased.Conclusion:Bevacizumab can induce apoptosis of HaCaT cells in vitro，and block cell cycle process effectively and arrest the cell cycle at G0/G1 phase.

HaCaT cells；Bevacizumab；apoptosis；proliferation

1徐州市兒童醫(yī)院，江蘇徐州，221006

2徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇徐州，221000

3靖江市人民醫(yī)院皮膚科，江蘇泰州靖江，214500

?通信作者