煙酰胺腺嘌呤二核苷酸對精子DNA碎片化指數(shù)的影響

李正濤，韓嘯

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸對精子DNA碎片化指數(shù)的影響

李正濤，韓嘯

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

目的研究煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）對精子DNA碎片化的作用，并探討此過程中的分子生物學(xué)機(jī)制。方法在差異濃度NAD（0、1、10、100、1 000 μmol/L）孵育下，觀察最適宜的精子NAD孵育濃度；采用BioVsion公司生產(chǎn)的NAD/NADH定量試劑盒測定精子NAD水平；采用流式細(xì)胞儀觀察精子DNA碎片率和染色質(zhì)成熟度；采用實(shí)時(shí)定量PCR觀察精子DNA單鏈修復(fù)酶PARP1和雙鏈修復(fù)酶BRCA1的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果10 μmol/L NAD孵育即能顯著增加精子NAD含量。在精子內(nèi)NAD水平顯著升高的同時(shí)，精子DNA碎片率明顯降低，然而精子染色質(zhì)成熟度不受精子NAD水平的影響。精子內(nèi)NAD水平能顯著影響精子內(nèi)DNA單鏈修復(fù)酶PARP1和雙鏈修復(fù)酶BRCA1的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)論這些結(jié)果初步提示，精子內(nèi)NAD水平可能通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)系統(tǒng)，參與精子DNA損傷修復(fù)。

精子；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；DNA碎片指數(shù)

精子DNA損傷是精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常及遺傳性狀變化的一個(gè)重要特征，同時(shí)與男性不育、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、輔助生殖技術(shù)臨床治療失敗密切相關(guān)［1，2］。因此，探索有效方法、增強(qiáng)精子DNA修復(fù)能力有顯著的臨床意義。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）廣泛參與細(xì)胞內(nèi)能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖分化等生物學(xué)效應(yīng)［3］。值得注意的是，NAD是聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）的輔助因子，過去研究證實(shí)PARP在單鏈DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用［4］，同時(shí)新近研究提示NAD廣泛參與DNA雙鏈修復(fù)因子乳腺癌易感基因1（breast cancer type 1 susceptibility protein，BRCA1）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［5］，因此本研究擬通過干預(yù)精子內(nèi)NAD水平，觀察精子DNA損傷與修復(fù)能力的變化。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2014年來我院就診的男性不育患者，年齡22～37歲，平均（31.5±4.5）歲。精液常規(guī)分析各項(xiàng)指標(biāo)均符合WHO手冊中精液正常標(biāo)準(zhǔn)。有精索靜脈曲張、酗酒、吸毒、生活或工作環(huán)境有污染的患者除外。禁欲2～7 d后，手淫法收集精液，37℃恒溫水浴箱孵育，待完全液化后行精子DNA碎片檢測，主要試劑均使浙江星博生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 NAD孵育

37℃條件下，分別用0（對照組）、1、10、100或1 000 μmol/L NAD（美國Sigma公司）孵育精子3 h。

1.3 NAD含量測定

NAD測定方法采用美國BioVsion公司生產(chǎn)的NAD/NADH定量試劑盒完成。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測

RNA提取試劑購于美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR相關(guān)試劑（PrimeScript RT Master Mix kit，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）購于日本TaKaRa公司，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PARP1上游引物：5′-GAGTCGGCGATCTTGGA CC-3′，下游引物：5′-TGACCCGAGCATTCCTCG-3′；BRCA-1上游引物：5′-GGCTATCCTCTCAGAGTGAC ATTT-3′，下游引物：5′-GCTTTATCAGGTTATGTTG CATGG-3′；內(nèi)參引物為GAPDH，上游引物：5′-AGG TGAAGGTCGGAGTCA-3′，下游引物：5′-GGTCATT GATGGCAACAA-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 差異濃度NAD孵育后精子內(nèi)NAD含量測定

在差異濃度（0、1、10、100、1 000 μmol/L）NAD孵育精子后，精子內(nèi)NAD水平逐漸升高。如圖1所示，與對照組相比，10 μmol/L NAD孵育即能顯著增加精子內(nèi)NAD含量，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但100和1 000 μmol/L NAD與10 μmol/L NAD相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 NAD孵育對精子NAD水平的影響Fig.1 NAD levels in sperms after incubation with different concentrations of NAD

2.2 流式細(xì)胞儀檢測NAD干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)及DNA穩(wěn)定性

如圖2所示，精子染色質(zhì)成熟度不受細(xì)胞外NAD孵育的影響（P＞0.05），然而10 μmol/L NAD孵育精子后，精子DNA碎片率顯著降低（P＜0.05）。這提示NAD可能參與細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)，而非影響染色質(zhì)成熟度。

圖2 NAD孵育對精子DNA完整性和染色質(zhì)成熟度的影響Fig.2 DNA fragmentation levels and stainability in sperms after incubation with NAD

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測NAD干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)酶的表達(dá)

圖2結(jié)果提示，NAD誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)能力改善，機(jī)制可能涉及DNA修復(fù)酶。因此，我們分別檢測了NAD孵育精子后細(xì)胞內(nèi)雙鏈和單鏈修復(fù)酶BRCA1和PARP1表達(dá)水平變化。NAD孵育后，精子內(nèi)NAD水平顯著升高（P＜0.05）（圖3A），BRCA1水平顯著提高（P＜0.05）（圖3B），然而DNA單鏈修復(fù)酶PARP1表達(dá)水平不受影響（P＞0.05）（圖3C）。我們意外發(fā)現(xiàn)，伴隨著精子NAD水平升高，細(xì)胞內(nèi)PARP1活性顯著升高（P＜0.05）（圖3D）。

圖3 NAD孵育對精子DNA損傷修復(fù)酶BRCA1和PARP1的作用Fig.3 Effects of NAD incubation on BRCA1 and PARP1 in sperm

3 討論

近年來，不孕不育發(fā)生率顯著升高［6］。已知男性少弱精子癥是不孕不育的主要因素，主要表現(xiàn)為精液中精子的數(shù)量和（或）活力顯著降低。然而，傳統(tǒng)精液分析（精子活力、密度和形態(tài)等）雖是評價(jià)精液質(zhì)量的重要指標(biāo)，但卻不能夠完整、客觀的反映出精子遺傳物質(zhì)（DNA）狀態(tài)。眾所周知，精子DNA的完整性是遺傳物質(zhì)能否正確傳遞給下一代的前提，在受精和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

近些年的研究也已經(jīng)證實(shí)，精子DNA斷裂水平與男性不育及精子數(shù)量和活力存在密切聯(lián)系，且顯著影響受精能力［7］。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，精子DNA的完整度是胚胎能否發(fā)育到胚泡期的重要因素之一［8］。在輔助生殖過程中，DNA完整性缺損的精子可更高程度的導(dǎo)致流產(chǎn)和胚胎停止，這也意味著DNA完整性損傷的精子在某種程度上雖然可以成功完成受精和著床，但仍然會(huì)導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局［9］。因此，研究精子DNA碎片的形成機(jī)制，建立更為有效的精子DNA損傷后治療方法，對男性生育力的提高和改善輔助生殖結(jié)局，具有相當(dāng)重要的臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)：（1）10 μmol/L NAD孵育即能顯著增加精子內(nèi)NAD含量；（2）在精子內(nèi)NAD含量顯著提升的同時(shí)，精子DNA碎片率明顯降低，然而精子染色質(zhì)成熟度不受精子內(nèi)NAD水平的影響；（3）值得注意的是，精子內(nèi)NAD水平能顯著影響精子內(nèi)DNA單鏈修復(fù)酶PARP1的活性和雙鏈修復(fù)酶BRCA1轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果初步提示，精子內(nèi)NAD水平可能通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)系統(tǒng)，參與精子DNA損傷修復(fù)。

綜上所述，提高精子NAD水平似乎是影響精子DNA碎片率的一個(gè)有效手段。另外，在男性原因所致的不孕不育治療過程中，關(guān)注精子遺傳物質(zhì)的狀態(tài)，探討改善精子DNA完整性的有效方法，將對男性生育能力的提高有顯著意義。

［1］Evgeni E，Charalabopoulos K，Asimakopoulos B.Human sperm DNA fragmentation and its correlation with conventional semen parameters［J］.J Reprod Infertil，2014，15（1）：2-14.

［2］楊大磊，潘伯臣，何麗霞，等.體外受精-胚胎移植中不同授精濃度對胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局的影響［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，43（1）：67-70.

［3］Imai SI，Guarente L.NAD+and sirtuins in aging and disease［J］. Trends Cell Biol，2014，24（8）：464-471.

［4］Schiewer MJ，Knudsen KE.Transcriptional roles of PARP1 in cancer［J］.Mol Cancer Res，2014，12（8）：1069-1080.

［5］Deng Y，Liu J，Han G，et al.Redox-dependent Brca1 transcriptional regulation by an NADH-sensor CTBP1［J］.Oncogene，2010，29（50）：6603-6608.

［6］Dunson DB，Baird DD，Colombo B.Increased infertility with age in men and women［J］.Obstet Gynecol，2004，103（1）：51-56.

［7］Kadioglu TC，Aliyev E，Celtik M.Microscopic varicocelectomy significantly decreases the sperm DNA fragmentation index in patients with infertility［J］.Biomed Res Int，2014，2014：695713.

［8］Seli E，Gardner DK，Schoolcraft WB，et al.Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization［J］.Fertil Steril，2004，82（2）：378-383.

［9］Carrell DT，Liu L，Peterson CM，el al.Sperm DNA fragmentation is increased in couples with unexplained recurrent pregnancy loss［J］. Arch Androl，2003，49（1）：49-55.

（編輯 陳姜）

EffectsofNicotinamide Adenine Dinucleotide on Sperm DNAFragmentation

LIZheng-tao，HANXiao
（DepartmentofObstetricsand Gynecology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effects of nicotinamide adenine dinucleotide（NAD）on sperm DNA fragmentation.MethodsSperms were incubated with 0，1，10，100 or 1 000 μmol/L NAD for screening of the optimum concentration of NAD intervention.NAD levels were determined by using NAD/NADH Quantification Kits according to the manufacturer′s instructions.DNA fragmentation index and high DNA stainability were evaluated by flow cytometry.Single and double stranded DNA repairenzyme were analyzed by realtime-PCR.Results10μmol/LNAD incubation can effectively increase the NAD content in sperms.Sperm DNA fragmentation was significantly decreased，along with the increased sperm NAD levels，buthigh DNAstainability was notaffected.Sperm single and double stranded DNArepairenzyme can be affected by sperm NAD levels.ConclusionTaken together，these results indicate that sperm NAD levels may be involved in sperm DNA damage repair through the regulation of the DNArepairsystem.

sperm；nicotinamide adenine dinucleotide；DNA fragmentation index

R321.1

A

0258-4646（2014）11-0999-04

李正濤（1981-），男，技師，本科. E-mail：lzt1220@aliyun.com

2014-09-01

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